编辑推荐：
本文利用高分辨率冷冻电镜，首次解析了经典/凝集素通路C4b2a-C3和替代通路C3bBbP-C3两种关键补体C3转化酶与其底物C3结合的Michaelis复合物结构。研究阐明了不同通路C3转化酶精确识别C3的分子基础，揭示了C4b2a组装激活的动态过程，并阐明了备解素（Properdin）稳定替代通路C3转化酶的具体机制，为理解补体激活的核心步骤提供了决定性结构见解，并为靶向C3转化酶的疗法设计奠定了理论基础。
补体系统是人体先天免疫防御的核心组成部分，它像一支高度协调的“快速反应部队”，负责识别和清除入侵的病原体、调节免疫反应并维持机体稳定。然而，一旦这支“部队”失控，过度激活或功能失调，就会“误伤”自身组织，导致包括肾脏疾病、风湿性疾病、神经系统疾病和心血管疾病在内的多种严重人类疾病。近年来，研究还发现补体系统失调与重症急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染后血栓形成等病理过程密切相关。因此，精确调控补体系统的激活，是治疗相关疾病的关键。
补体系统的激活主要通过三条“路径”启动：经典途径、凝集素途径和替代途径。无论哪条路径，其“兵工厂”最终都汇聚于一个核心“弹药”——补体第三组分（C3）。C3需要被专门的“切割酶”——C3转化酶——精准切割，才能释放出具有活性的片段C3a和C3b，从而启动后续一连串的免疫级联反应。其中，经典和凝集素途径使用C4b2a复合物作为C3转化酶，而替代途径则使用C3bBb复合物。这两种转化酶就像两把关键的“分子剪刀”，决定了整个补体反应能否有效进行。
然而，这两把“剪刀”本身非常不稳定，形成后几分钟内就会解体，这给研究它们如何精确“抓住”并“剪开”C3底物带来了巨大挑战。尽管过去的研究通过解析C3bB酶原复合物以及C3bBb与抑制剂SCIN的复合物结构，对替代途径转化酶的组装有了初步认识，但C3转化酶识别底物的精确分子机制，以及经典/凝集素途径C4b2a转化酶的组装与激活过程，仍然笼罩在迷雾之中。为了拨开这层迷雾，一个研究团队通过尖端技术，捕捉到了这些“分子剪刀”在工作状态下的高清三维图像。
研究人员利用高分辨率冷冻电子显微镜（cryo-EM），成功解析了处于功能状态的三种关键复合物的原子级结构：这包括了：1）经典/凝集素途径C4b2a转化酶与底物C3结合的“Michaelis复合物”（反应中间态）结构（分辨率3.1埃）；2）C4b2酶原（即C4b与未切割的C2形成的复合物）的“装载”状态（2.9埃）和“激活”状态（3.1埃）结构；以及3）在备解素（Properdin, P）存在下的替代途径C3bBb转化酶与底物C3结合的Michaelis复合物结构（2.6埃）。这些高清“快照”系统揭示了补体激活核心步骤的精细蓝图，相关成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上。
主要技术方法
本研究主要采用以下技术：1）蛋白质纯化：从人血浆中纯化天然C3和C4，并通过蛋白酶处理制备C3b和C4b；利用人胚肾（HEK）293F细胞表达系统制备重组C2、因子B（FB）、因子D（FD）及其催化失活突变体（S679A和S699A），以及插入了烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切割位点的单体化备解素。2）复合物组装与冷冻电镜样品制备：将纯化的蛋白质按特定摩尔比混合，并在金属离子（Ni2+）存在下，经蛋白酶（C1s或FD）短暂处理以形成转化酶-底物复合物，随后快速冷冻制备样品。3）高分辨率冷冻电镜数据采集与处理：使用300-kV Titan Krios G4显微镜采集数据，并利用CryoSPARC软件进行数据处理、三维重构和局部分析。4）原子模型搭建与精修：基于冷冻电镜密度图，使用AlphaFold2预测和已有结构作为初始模型，通过Coot和PHENIX软件进行手动搭建、修正和精修，最终获得高精度的原子结构模型。
研究结果
Cryo-EM structure of the C4b2a-C3 complex（C4b2a-C3复合物的冷冻电镜结构）
研究人员成功捕获了C4b2a与C3结合的Michaelis复合物。在该结构中，C4b呈现出与C3b相似的典型“傀儡师”活性构象。底物C3则保持非活性构象，其硫酯结构域（TED）被安全地折叠在CUB和MG8结构域下方。C2a通过其von Willebrand A（vWA）结构域结合在C4b的C345C结构域上，而其丝氨酸蛋白酶（SP）结构域则转向C3，为底物切割做好准备。
Substrate recognition mechanism of C4b2a（C4b2a的底物识别机制）
结构分析揭示了C4b2a特异性识别C3的精细机制。C4b和C2a共同参与了对C3的识别，确保了底物特异性。C4b与C3之间的界面涉及多个巨球蛋白（MG）结构域，形成了约24个氢键和盐桥相互作用。C2a则通过其SP结构域捕获了C3的“剪切环”（包含Arg748-Ser749切割位点），将其精准地定位在由Asp561-His507-Ser679（Ala）组成的催化三联体中心。特别值得注意的是，C3的结合诱导了C2a-SP中Lys676构象变化，从而形成了一个功能性的氧阴离子空穴，为催化反应做好了准备。
Formation of the classical and lectin pathway C3 convertase（经典和凝集素途径C3转化酶的形成）
通过解析C4b2酶原的“装载”和“激活”状态结构，并结合C4b2a-C3复合物结构，研究人员可视化了C3转化酶形成的动态过程。在装载状态，C2（对应FB）的CCP1-CCP3和vWA结构域与C4b结合。在激活状态，C2的SP结构域构象变得稳定并锚定在C4b上。当C2被C1s或MASP2切割、释放C2b片段后，形成的C2a（vWA-SP）会发生巨大的构象重排：vWA结构域发生位移，而SP结构域则围绕vWA-SP连接区摆动约118度，使其能够有效地对接C3底物。这种大幅度的构象变化解释了C4b2a转化酶的内在不稳定性。
Cryo-EM structure of the C3bBbP-C3 complex（C3bBbP-C3复合物的冷冻电镜结构）
研究人员同样解析了替代途径C3bBb转化酶在备解素存在下与C3结合的Michaelis复合物结构。在该结构中，C3b与C3形成了一个类二聚体界面，但相互作用面积略小于C4b-C3界面。Bb与C3的相互作用展现出独特特征：Bb-SP结构域中一个更长的β-发夹结构（β-hairpin）能诱导C3的α′-NT区域形成一段短链，从而更好地结合底物。此外，Bb的Asp723能更有效地结合C3的Arg748（P1残基）。
Stabilization of C3bBb by properdin（备解素对C3bBb的稳定作用）
结构清晰地展示了备解素如何稳定C3bBb转化酶。备解素主要通过与C3b的C345C结构域结合来发挥作用。更重要的是，其TSR5-stirrup和TSR6-stirrup两个关键环插入到C3b与Bb的界面之间，像一个“分子胶水”一样增强了两者之间的相互作用。例如，备解素的Arg329既与C3b的Phe1659堆叠，又与Bb主链的Leu349形成氢键。此外，与C3bBP酶原复合物相比，在成熟的C3bBbP结构中，备解素的Arg330发生了显著旋转，帮助锚定C3b的末端残基，从而维持C3b与Bb-vWA中金属离子依赖的粘附位点（MIDAS）的结合，进一步稳定了转化酶。
研究结论与意义
这项研究通过解析C4b2a-C3和C3bBbP-C3两种Michaelis复合物的高分辨率冷冻电镜结构，首次在原子层面上全面揭示了经典/凝集素途径和替代途径C3转化酶识别其共同底物C3的精确分子机制。研究发现，尽管两条通路的转化酶（C4b2a和C3bBb）在整体结构上相似，但在底物结合细节上存在显著差异：C4b与C3的相互作用界面更优化，而Bb则通过更长的β-发夹和更好的带电荷残基互补来增强与C3的结合。研究还动态展示了C4b2a从酶原装载、激活到最终结合底物的构象变化过程，并阐明了备解素通过其特定的环状结构插入C3b-Bb界面，充当“分子稳定器”的具体机制。
这些发现具有深远的意义。首先，研究为理解补体激活的核心步骤提供了决定性的结构框架，解决了该领域长期悬而未决的关键问题。其次，通过序列比对，研究指出相较于小鼠，大鼠的C4与人类更为相似，这可能为选择更合适的临床前动物模型提供了依据。再者，研究为针对C3转化酶开发治疗补体相关疾病的新药指明了方向。例如，通过将已获批药物pegcetacopan（一种compstatin家族环肽）和iptacopan（一种FB抑制剂）的结合位点与本研究解析的结构进行比对，清晰地展示了它们如何通过空间位阻或直接占据底物结合位点来抑制转化酶功能。这为优化现有药物和理性设计靶向C2（针对经典/凝集素途径）的新型小分子抑制剂提供了蓝图。最后，该研究建立的模型也有助于未来探索C5转化酶的组装机制以及备解素寡聚体在补体终端通路激活中可能扮演的局部聚集作用。总而言之，这项工作从根本上增进了我们对补体系统这一关键免疫“开关”的理解，并将推动针对多种补体介导疾病的精准疗法的开发。
