《SCIENCE ADVANCES》：KRASG12V/HLA-A*02:01–targeted chimeric antigen receptor T cells exhibit potent preclinical activity against solid tumors
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本研究针对实体瘤靶向治疗缺乏高特异性靶点的难题，研发了靶向KRASG12V新抗原/HLA-A*02:01复合体的CAR-T细胞。研究证实，所构建的B9 CAR-T细胞在体外及多种体内模型中均能特异性杀伤肿瘤，并展现出良好的安全性，为携带该突变的广泛患者群体提供了一种极具前景的精准免疫治疗新策略。
在癌症治疗的战场上，针对血液肿瘤的CAR-T（嵌合抗原受体T）细胞疗法已取得了革命性的成功，然而，面对更常见的实体瘤，科学家们却屡屡受挫。其中一个核心瓶颈在于难以找到“理想靶点”——这些靶点必须只在肿瘤细胞上大量表达，而在正常组织中几乎绝迹，从而确保治疗既能精准“歼敌”，又不会“误伤友军”。传统的肿瘤相关抗原往往难以满足这一苛刻要求，导致疗效不佳或引发严重的脱靶毒性。
那么，是否存在一种近乎完美的靶点呢？答案是肿瘤特异性新抗原，它们源于肿瘤细胞独有的基因突变，是真正的肿瘤“身份证”。在众多癌基因突变中，KRAS基因突变极为常见，堪称“癌中之王”的胰腺癌中超过90%的患者携带此突变。其中，KRAS第12号密码子的缬氨酸突变（G12V）在胰腺癌、结直肠癌和肺癌中高频率出现，却因结构“光滑”而一直缺乏有效的靶向药物，成为临床上亟待攻克的堡垒。此外，针对此类细胞内新抗原的T细胞疗法还受限于人类白细胞抗原（HLA）的多样性，既往研究多聚焦于在亚洲人群常见的HLA-A*11:01等亚型，限制了其在全球更广泛患者中的应用。
因此，开发一种能够靶向KRASG12V这一高发突变，且能与在欧美人群中高频分布（约30-50%）的HLA-A02:01分子相结合的新型免疫疗法，具有巨大的临床价值和市场潜力。近期发表在顶级期刊《SCIENCE ADVANCES》上的一项研究，成功将这一设想变为现实。中国研究人员通过噬菌体抗体展示技术筛选出高亲和力抗体，构建了靶向KRASG12V/HLA-A02:01复合体的新型CAR-T细胞，并在临床前研究中展现出卓越的抗肿瘤活性和安全性。
为了开展此项研究，研究人员运用了几个关键的技术方法：首先，利用噬菌体抗体展示技术从健康人源单链可变区片段（scFv）文库中筛选并鉴定出能特异性结合KRASG12V/HLA-A02:01复合体的高亲和力抗体（B9与A4）。其次，构建了表达不同靶点组合的工程化细胞系（如K562）以及来源于患者的结直肠癌类器官（PDO）模型，用于体外功能验证。再者，通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）深入解析了CAR-T细胞激活后的转录组异质性。最后，在免疫缺陷小鼠（NCG）中建立了皮下、转移性及腹膜播散性胰腺导管腺癌（PDAC）等多种体内模型，并利用表达人HLA-A02:01的转基因小鼠（NCG-HLA-A2.1）和免疫健全的C57BL/6小鼠模型，全面评估了CAR-T细胞的疗效与安全性。
研究结果
筛选针对KRASG12V/HLA-A02:01复合体的特异性scFv并构建CAR-T细胞结构*
研究人员通过生物信息学分析确认了KRASG12V突变在多种实体瘤中的高发性，并选择了人群分布广泛的HLA-A02:01等位基因。通过多轮噬菌体展示筛选与验证，从近千个克隆中鉴定出两个（A4和B9）能特异性结合KRASG12V/HLA-A02:01复合体、而不结合野生型复合体的单克隆抗体。其中B9抗体表现出更高的亲和力（EC50= 2.589 nM）。利用这些scFv，研究团队成功构建了A4.CAR和B9.CAR两种CAR-T细胞，并验证了其高转导效率和以效应记忆T细胞为主的表现。
B9 CAR-T细胞诱导杀伤KRASG12V/HLA-A02:01阳性肿瘤*
体外功能实验表明，B9 CAR-T细胞能特异性识别并高效杀伤经KRASG12V肽段脉冲或内源性表达KRASG12V/HLA-A*02:01的肿瘤细胞系（如CFPAC-1、SW620），同时释放高水平的干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。这种杀伤作用严格依赖靶点的存在，当敲除肿瘤细胞的KRAS基因或抗原提呈关键蛋白β2微球蛋白（B2M）后，杀伤作用消失。B9 CAR-T细胞对另一种常见突变KRASG12C无反应，显示出高度的特异性。
B9 CAR-T细胞对患者来源的CRC类器官展现出强效细胞毒作用
为了在更接近临床的模型中验证疗效，研究团队建立了来自KRASG12V阳性结直肠癌（CRC）患者的肿瘤类器官（PDO）。结果显示，B9 CAR-T细胞能有效诱导靶向类器官发生caspase-3依赖的凋亡，并分泌大量IFN-γ和TNF-α，而对KRASG12V阴性的对照类器官无此作用，证明了其在模拟人体肿瘤微环境中的有效性和特异性。
单细胞转录组图谱揭示B9 CAR-T细胞在抗原特异性激活过程中的代谢和功能异质性
通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，研究人员发现，与未转导（UTD）的T细胞相比，B9 CAR-T细胞在抗原刺激后，增殖性T细胞和记忆T细胞亚群显著扩增。深入分析表明，这些扩增的细胞亚群高表达细胞因子（如IFN-γ）并富集于PI3K-Akt、MAPK等关键的T细胞激活通路，同时其能量代谢活动（如氧化磷酸化、糖酵解）显著增强，为其强大的效应功能提供了代谢基础。
B9 CAR-T细胞抑制皮下PDAC异种移植瘤的生长
在免疫缺陷小鼠皮下胰腺癌模型中，单次输注B9 CAR-T细胞能有效控制肿瘤生长，显著延长小鼠生存期，所有治疗组小鼠存活超过80天，而对照组在60天内全部死亡。
B9 CAR-T细胞在人转移性PDAC模型中显示治疗效果
在经静脉注射建立的血行转移模型中，B9 CAR-T细胞能剂量依赖性地抑制CFPAC-1肿瘤细胞的扩散和生长。相反，对于仅表达HLA-A*02:01而不表达KRASG12V的Caco-2肿瘤细胞，B9 CAR-T细胞则无治疗作用，再次印证了其杀伤的严格特异性。
B9 CAR-T细胞清除PDAC模型中的腹膜转移灶
在模拟临床腹膜转移的模型中，腹腔输注B9 CAR-T细胞能完全清除腹腔内肿瘤，并为小鼠带来显著的生存获益。
B9 CAR-T细胞的全面脱靶分析揭示关键识别基序以及与人类蛋白质组的极小交叉反应性
为确保安全性，研究人员进行了细致的脱靶评估。通过氨基酸扫描（X-scan）突变分析，确定了B9 CAR-T细胞识别KRASG12V肽段的关键氨基酸位点。基于此识别基序，在整个人类蛋白质组中进行生物信息学搜索和亲和力预测，仅发现两个（RNF112和SUOX来源的）潜在交叉反应肽段，且在功能验证中其激活CAR-T细胞的能力远弱于目标肽段。
B9 CAR-T细胞未显示潜在的体内毒性
在表达人HLA-A*02:01的转基因NCG小鼠（NCG-HLA-A2.1）中进行安全性评估。输注B9 CAR-T细胞一个月内，小鼠体重稳定，血常规指标无显著异常，主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的组织病理学检查未发现T细胞异常浸润或损伤，初步证明了其良好的体内安全性。
在完全免疫健全的小鼠模型中评估B9 CAR-T细胞的安全性和有效性
为进一步验证在具有完整免疫系统的环境中的安全性，研究团队构建了免疫健全的C57BL/6小鼠模型。输注经过鼠源化改造的B9 CAR-T细胞后，不仅有效抑制了肿瘤生长，延长了生存期，且未引起明显的体重下降、细胞因子释放综合征或器官损伤，在免疫健全背景下再次验证了其治疗潜力和安全性。
结论与讨论
本研究的核心结论是成功开发了一种靶向KRASG12V/HLA-A02:01新抗原复合体的CAR-T细胞疗法。与目前主要针对KRASG12C和G12D的小分子抑制剂，或受限于HLA-A11:01等特定亚型的T细胞受体疗法相比，该研究具有多重重要意义。首先，它攻克了KRASG12V这一长期缺乏靶向治疗选项的高发突变难题。其次，所选用的HLA-A*02:01等位基因在全球尤其是欧美人群中有更高的分布频率，使得该疗法有望惠及更广泛的患者群体。再者，研究采用的噬菌体抗体展示平台具有高通量、高效率筛选的优势，为未来针对其他新抗原或HLA亚型开发多靶点联合疗法奠定了技术基础。
在安全性方面，通过多层次、多模型的严谨评估，证实了B9 CAR-T细胞具有高度的靶点特异性和可接受的脱靶风险谱。尽管临床前模型存在局限性，但现有数据为其向临床转化提供了强有力的支持。总之，这项研究不仅为KRASG12V突变的实体瘤患者带来了新的治疗希望，也展示了将新抗原靶向策略与优势HLA等位基因相结合以开发“通用型”精准免疫疗法的巨大潜力，为未来针对实体瘤的CAR-T细胞治疗开辟了新道路。
