微生物转运蛋白EgtU通过烷基CH•••S氢键特异性识别麦角硫因（ET）的分子机制

《SCIENCE ADVANCES》：CH???S hydrogen bonds drive molecular recognition of ergothioneine by the microbial transporter

为揭示微生物ATP结合盒（ABC）转运蛋白EgtU特异性识别膳食抗氧化剂麦角硫因（ET）的分子基础，研究者采用“嵌合”诱变、等温滴定量热法（ITC）、晶体学和分子动力学（MD）模拟等多种技术，系统探究了EgtU溶质结合域EgtUC中一系列烷基CH•••S氢键对ET识别的关键作用。研究发现，微小的CH•••S氢键几何扰动会显著缩短ET结合“闭合”态的寿命，并通过远端NH•••O氢键的弱化增加结合口袋的运动紊乱，从而解释了EgtU对含硫酮基芳香族代谢物的高度特异性。该工作突出了烷基CH•••S氢键在水相生物蛋白质-配体复合物分子识别中的重要影响。

　　

在人体中，麦角硫因（Ergothioneine, ET）是一种强大的膳食抗氧化剂和细胞保护剂，具有潜在的治疗价值。有趣的是，许多细菌也依赖这种低分子量硫醇来维持自身的氧化还原平衡，并通过一种名为EgtU的ATP结合盒（ABC）转运蛋白来摄取它。EgtU对ET的识别具有惊人的特异性，它能将ET与仅缺少硫原子的类似物L-hercycine（HER）的亲和力区分开高达10⁴倍。这种特异性是如何实现的？一个关键的线索在于ET分子中独特的硫酮硫原子。研究人员推测，EgtU的溶质结合域EgtUC可能通过一组非共价相互作用——特别是烷基CH•••S氢键——来“锁定”这个硫原子，从而精确地区分ET和其他分子。为了验证这一假设并深入理解其分子机制，一个研究团队对此展开了系统性的探索，相关成果发表于《SCIENCE ADVANCES》。

为了深入探究EgtU识别ET的分子机制，研究人员综合利用了多种生物物理和结构生物学技术。关键方法包括：利用“嵌合”诱变策略构建EgtUC突变体；通过等温滴定量热法（ITC）精确测定ET与野生型及突变体蛋白结合的热力学参数（如结合常数K_a、焓变ΔH等）；运用X射线晶体学解析了多个ET结合态EgtUC突变体的高分辨率结构；通过核磁共振（NMR）光谱分析了蛋白质的动态构象变化和结合态寿命；并进行了全原子分子动力学（MD）模拟，以纳米尺度观察结合口袋内的相互作用动态。此外，研究还在肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）中构建了相应突变菌株，通过同位素稀释硫醇谱分析法评估了突变对细胞摄取ET功能的影响。

CH•••S氢键影响ET结合亲和力与热力学

研究人员首先通过ITC分析了关键残基突变对ET结合的影响。结果表明，破坏与硫原子形成CH•••S氢键的残基（如I243）会显著降低结合亲和力，其中I243P突变使亲和力下降约1000倍，且焓变（ΔH）减小是主要因素。相比之下，T274G突变对结合几乎无影响，说明骨架Hα原子形成的CH•••S氢键比侧链γ-甲基的贡献更重要。这些数据揭示了不同烷基C─H键作为氢键供体的强度差异（Hα > 次甲基 > 甲基），并首次量化了这些CH•••S相互作用在ET特异性识别中的能量贡献。

ET结合突变体SpEgtUC的晶体结构与野生型蛋白全局一致

尽管结合亲和力差异巨大（高达三个数量级），但解析的I243A、I243P、T274G和I243P/T274G突变体EgtUC与ET复合物的晶体结构显示，其全局结构与野生型几乎相同。结合口袋的几何形状，包括与ET甜菜碱部分相互作用的芳香笼，都得以保留。结构分析表明，I243P突变主要导致了CH•••S氢键距离和角度的微小扰动，而更常规的NH•••O/N氢键（如K242和R379与ET羧酸盐形成的静电钳）在结构上变化极小（±0.2 ?）。这暗示微小的结构扰动可能通过影响动力学而非静态结构来削弱结合。

I243A和I243P SpEgtUC的NMR研究揭示更短的闭合态寿命和弱化的氢键

NMR动力学研究表明，野生型SpEgtUC在结合ET前后存在慢化学交换（≈毫秒级）的“开放”与“闭合”构象转换。I243A突变使复合物进入中间交换状态，而I243P突变则进入快交换状态。估算表明，I243P突变体的闭合态寿命（τ ≈ 150 μs）比野生型（τ ≈ 150 ms）短约1000倍。特别值得注意的是，在I243P突变体中，尽管关键残基R379的NH_ε化学位移与野生型相似，但其信号强度显著减弱，¹⁵N-¹H-hNOE值减小，表明其与D381之间的氢键被削弱，动态无序性增加。这证实了远端氢键网络的稳定性因近端CH•••S氢键的扰动而受损。

WT与I243P SpEgtUC的分子动力学模拟显示CH•••S氢键扰动后的动力学变化

为期1微秒的全原子分子动力学模拟提供了时间分辨的视角。在野生型复合物中，CH•••S氢键和常规NH•••O氢键均保持稳定。然而，在I243P突变体模拟中，观察到了ET解离的罕见事件。分析发现，尽管突变体的CH•••S氢键动态与野生型相似，但其静电钳（K242和R379与ET羧酸盐的NH•••O氢键）的距离分布呈双峰，表明这些氢键在大部分模拟时间内处于断裂状态，D381侧链羧酸盐也出现旋转。模拟结果与NMR数据一致，表明CH•••S氢键的微小扰动主要导致远端常规氢键网络的动力学失稳，进而引发配体解离。

EgtUC突变体在肺炎链球菌细胞中表现出降低的ET摄取能力

最后，研究在肺炎链球菌中构建了携带突变EgtU的菌株，并评估其ET摄取功能。尽管在静态终点测定中差异不明显，但在动力学实验中，添加低浓度ET后，I243P突变菌株在所有时间点积累的ET量均显著低于野生型菌株。这证明，I243P突变导致的结合亲和力下降和闭合态寿命缩短，确实转化为了细胞内ET摄取动力学的功能性缺陷。

研究结论与讨论

本研究系统阐明了烷基CH•••S氢键在微生物转运蛋白EgtU特异性识别麦角硫因（ET）中的核心作用。研究发现，EgtUC中一系列指向ET硫酮硫原子的烷基CH•••S氢键是分子识别的关键决定因素。这些氢键作为“锚点”，稳定了ET的硫代咪唑环在结合口袋中的位置。值得注意的是，对单个CH•••S相互作用的微小扰动（如I243P突变），虽未显著改变静态晶体结构，却通过削弱远端的NH•••O氢键网络（即围绕ET羧酸盐的静电钳），急剧缩短了转运活性构象（闭合态）的寿命，并最终损害了细菌细胞摄取ET的动力学效率。这项工作首次在水相生物蛋白质-配体复合物中，清晰揭示了烷基CH•••S氢键对分子识别和功能的深远影响。EgtU对含硫酮基团的严格依赖，为理解微生物竞争利用ET的机制提供了新视角，并可能为针对该转运蛋白开发广谱抗菌策略奠定基础。