营养匮乏诱导蓝藻Cyanocohniella rudolphia分泌可溶性胞外聚合物：一项为期180天的生理生化响应与生物过程强化研究

《Algal Research》：Nutrient deprivation stimulates soluble extracellular polymeric substances: physiological and biochemical responses in the cyanobacteria Cyanocohniella rudolphia

针对可溶性胞外聚合物（S-EPS）传统生产方式存在产量低、监测难、下游处理复杂等问题，研究人员以海洋蓝藻Cyanocohniella rudolphia为模型，通过为期180天不更换培养基的营养匮乏长期培养策略，系统探究了S-EPS的生产动态与生理基础。研究发现，渐进性营养耗竭促使细胞代谢从生物量增长转向胞外基质投资，S-EPS产量（0.8 g L?1）与上清液表观粘度（34.7 mPa·s）同步显著提升，且二者强相关（R2= 0.86），验证了表观粘度作为S-EPS原位监测的实用指标。此研究为基于低输入、资源节约型生物过程强化S-EPS生产提供了有效策略与操作工具。

　　

在追求可持续发展的浪潮中，科学家们正致力于从自然界寻找可再生的生物聚合物，以替代部分石化产品。蓝藻，这些古老的光合微生物，因其能够利用阳光、二氧化碳和简单无机物生产多种代谢产物而备受关注。其中，胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances, EPS）尤为引人瞩目，它们在环境保护、生物材料、化妆品和食品工业中具有广阔的应用潜力。EPS就像一个由多糖、蛋白质等组成的“保护罩”和“社交网络”，帮助蓝藻抵御干旱、紫外辐射等胁迫，并促进细胞粘附与聚集。在应用层面，可溶性胞外聚合物（Soluble EPS, S-EPS）因可直接从无细胞上清液中回收，具有下游处理简便的优势。然而，如何高效、低成本地大规模生产S-EPS仍是当前面临的关键挑战。传统策略多依赖于短期培养或剧烈的营养胁迫，对长期、渐进性胁迫下的S-EPS生产动态缺乏深入了解，同时也缺少简单、非破坏性的过程监测指标。针对这些问题，一项发表于《Algal Research》的研究为我们提供了一种新颖而实用的解决方案。

为了回答上述问题，由Filipa Rodrigues、Ivana Mendon?a等人组成的研究团队，以海洋蓝藻Cyanocohniella rudolphia (BEA 0786B)为研究对象，设计了一项长达180天、不更换培养基的培养实验，系统探究了渐进性宏观与微观营养耗竭对其生长、生理及S-EPS生产的影响。研究旨在阐明长期营养匮乏下的S-EPS生产动力学，揭示生理胁迫响应与胞外基质发育的关联，并评估培养液表观粘度作为S-EPS积累过程监测指标的可行性。

研究人员采用的主要技术方法包括：对蓝藻进行长达180天不更换培养基的批次培养，模拟渐进性营养胁迫；通过测定光密度（OD₇₅₀）和干重监测生长，并计算比生长速率；使用酚-硫酸法（Phenol?sulfuric acid assay）定量无细胞上清液中的可溶性胞外碳水化合物（以葡萄糖当量计）；采用Lowry法测定胞外蛋白质（以BSA当量计）；利用阿利新蓝（Alcian Blue）染色对酸性多糖进行定性分析；使用流变仪测定无细胞上清液在特定条件下的表观粘度（η_app）；通过衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）和扫描电子显微镜（SEM）对生物质及纯化的S-EPS进行结构表征；并探索性地利用废培养基中的S-EPS，在光引发剂（LAP）和365 nm紫外光作用下，光化学合成金（Au）和银（Ag）纳米颗粒，以验证其直接利用潜能。

研究结果

3.1. 营养匮乏下的培养动态

培养过程中，营养浓度未被直接量化，但细胞在无培养基更新的情况下持续摄取养分，导致了渐进性的营养胁迫。培养物的光密度和干生物量在实验前期呈现非经典的增长模式，约在第60-75天达到顶峰后开始下降。由光密度和干生物量计算得出的表观比生长速率（μ₁和 μ₂）也随培养时间延长而下降，表明长期营养耗竭下生长能力逐渐丧失。培养液的pH值在前期因光合作用而稳步上升，至第75天达到10.3的峰值，随后下降。这些动态变化共同指示了培养物从初始状态逐渐过渡到营养限制乃至饥饿的生理状态。

3.2. S-EPS动态与表观粘度

无细胞上清液中的可溶性胞外碳水化合物（S-EPS的主要组分）在整个180天实验期内持续积累。同时，上清液的表观粘度也呈现出阶段性上升，从第15天开始增加，到第75天达到一个高位平台并维持至实验结束。统计分析显示，表观粘度与通过超滤/冻干法测得的S-EPS产量之间呈强正相关（R²= 0.86），与酚-硫酸法测得的碳水化合物浓度也高度相关（R²= 0.90）。这表明表观粘度可以作为监测S-EPS积累的有效、非破坏性过程参数。S-EPS产量从初始的约0.1 g L^?1增加到第180天的0.8 g L^?1，而表观粘度相应地从24.7 mPa·s增加到34.7 mPa·s。

3.3. 营养匮乏下的细胞与生化响应

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  显微观察：光学显微镜和扫描电镜观察显示，随着培养时间延长，蓝藻丝状体从分散状态逐渐形成微菌落（约第45天），最终被致密的粘液状胞外基质包裹。阿利新蓝染色证实了这些胞外基质中含有酸性多糖。
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  光合色素动态：叶绿素a含量在胁迫中期下降，而总类胡萝卜素含量相对增加，叶绿素b在后期有所上升。这些变化反映了在营养胁迫下，光合机构进行了重配置，从生长导向转向光保护和胁迫适应。
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  胞外蛋白质动态：无细胞上清液中的蛋白质浓度在第75天达到峰值后下降。这种先升后降的模式可能与胁迫早期分泌粘附蛋白等相关，而在深度营养匮乏（饥饿）阶段，氮素被循环利用。

3.4. 结构表征

对生物质和纯化S-EPS的ATR-FTIR分析表明，随着培养时间推移，生物质的红外光谱显示多糖和蛋白质特征峰增强，脂质相关峰减弱。纯化的S-EPS光谱则主要由多糖特征峰主导，同时伴有明显的酰胺I带和II带，表明含有蛋白质组分。元素分析显示，S-EPS中的氮含量随时间增加，碳氮质量比从第15天的34:1下降至第180天的15:1，证实了后期S-EPS中蛋白质贡献比例的相对增加。

3.5. 探索性概念验证：利用废培养基S-EPS合成等离子体纳米颗粒

作为概念验证，研究直接利用废培养基中的S-EPS，在LAP光引发剂和365 nm紫外光照射下，成功光化学合成了金和银纳米颗粒。透射电镜显示形成了形态不规则的纳米颗粒聚集体。重要的是，由此得到的S-EPS-金纳米颗粒体系展现出pH响应性的光学行为（颜色随pH变化），表明S-EPS不仅能作为绿色还原剂和稳定剂，还能赋予纳米材料环境刺激响应特性。

研究结论与意义

本研究证实，长期营养匮乏（不更换培养基）是强化蓝藻Cyanocohniella rudolphia生产可溶性胞外聚合物（S-EPS）的有效策略。渐进性营养耗竭促使细胞代谢发生重编程，将光合固定的碳从生物量合成重新分配至胞外多糖生产（即“碳溢出”效应），从而导致S-EPS在培养液中持续积累。培养液的表观粘度与S-EPS积累量高度相关，这为实际生物工艺过程提供了一个简单、非破坏性的原位监测指标，可用于触发最佳收获时间（例如第60-180天）。

该研究的意义在于：首先，它提出了一种低输入、资源节约型的S-EPS生产强化方法，通过长期培养直接利用“废”培养基，减少了化学试剂使用和下游处理步骤。其次，验证了表观粘度作为过程分析技术（PAT）工具的实用性，有助于实现S-EPS生产的标准化和过程控制。最后，探索性研究展示了废培养基S-EPS在绿色合成刺激响应性纳米材料方面的潜力，拓宽了蓝藻EPS的高值化应用途径，为将蓝藻培养整合入生物精炼框架、实现资源全利用提供了新的思路和操作基础。