《Algal Research》：Discovery and characterization of novel fucoidanases for depolymerization of
Macrocystis pyrifera fucoidan
编辑推荐：
为解决岩藻聚糖（fucoidan/FCSPs）结构复杂性与命名混乱长期阻碍其系统研究与生物技术应用的难题，本研究以巨藻（Macrocystis pyrifera）为原料，开发了温和提取方法以获取结构更近天然的高分子量、高硫酸化岩藻聚糖，并以此为基础成功鉴定出六个新型岩藻聚糖酶（fucoidanase，分属GH107和GH168家族），详细表征了其底物特异性与解聚机制。这项工作不仅扩展了岩藻聚糖加工的酶工具箱，还对M. pyrifera岩藻聚糖进行了全面的结构分析，并通过提出标准化的命名系统推进了该领域概念的清晰化。
褐藻是海洋生态系统的关键角色，也是一种有着数千年人类利用历史的丰富、可再生资源。它们分泌的细胞外基质中含有独特的阴离子多糖，其中就包括岩藻聚糖。这种物质不仅是极具前景的治疗剂，还在生物地球化学碳循环中扮演着重要角色。然而，岩藻聚糖的结构极其多样和复杂，在分子层面尚未完全解析。这一挑战长期以来阻碍了其系统性研究和向生物技术应用的转化。更令人头疼的是，这种结构上的模糊性还导致了该领域术语的不一致，同一个物质可能有多种叫法，给科研交流与合作带来了不少麻烦。那么，有没有可能通过更温和的方法获取接近天然结构的岩藻聚糖，并利用它来发现更高效的降解工具，从而“看清”其真面目并统一大家的“语言”呢？
为了回答这些问题，一项发表在《Algal Research》上的研究给出了肯定的答案。研究人员将目光投向了巨大的褐藻——巨藻（Macrocystis pyrifera）。他们开发了一种温和的提取程序，旨在保护岩藻聚糖的天然结构，最终从巨藻生物质中获得了一种高分子量、高度硫酸化的岩藻聚糖。研究团队利用这种材料作为底物，从专业的岩藻聚糖降解菌属Lentimonas spp.和一个深海热液喷口宏基因组中，成功鉴定出六个新型的岩藻聚糖降解酶（fucoidanases），它们分别属于糖苷水解酶（Glycosyl Hydrolase， GH）家族GH107和GH168。
为了开展这项研究，作者团队主要运用了以下几项关键技术方法：首先，他们建立了基于中性pH、低温条件的岩藻聚糖温和提取与纯化流程，并结合海藻酸裂解酶处理和超滤进行纯化。其次，利用高效的阴离子交换色谱（HPAEC）、尺寸排阻色谱（SEC）和流变学测量对提取的岩藻聚糖进行了全面的成分、分子量及流体性质表征。在酶学发现方面，通过生物信息学方法从目标微生物基因组和宏基因组中筛选候选酶基因，并在大肠杆菌（E. coli）中进行了重组表达与纯化。最后，综合利用尺寸排阻色谱、基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）、碳水化合物聚丙烯酰胺凝胶电泳（C-PAGE）、还原末端测定以及核磁共振（NMR）波谱等多种分析技术，系统地表征了这些新型岩藻聚糖酶的活性、底物特异性、作用模式和最终降解产物。
研究结果分为几个主要部分：
3.1. 岩藻聚糖提取和初步表征
研究人员成功开发并应用了一种温和的中性提取方案，从干燥的巨藻生物质中提取到了高分子量（约800 kDa）且高度硫酸化（硫酸化程度为2.13）的岩藻聚糖。成分分析显示岩藻糖是主要单糖，并含有少量半乳糖、木糖、葡萄糖和甘露糖。与传统的酸提或热水提取法相比，该方法更好地保留了岩藻聚糖的天然高分子量和硫酸化特征。
3.2. 流变学表征
对提取的岩藻聚糖溶液进行流变学分析，发现其表现出非牛顿流体的剪切稀化行为，并在高剪切速率下观察到表观剪切增稠现象。这一特性暗示该岩藻聚糖可能具有支链结构，类似于此前对某些褐藻岩藻聚糖提出的模型。
3.3. 新型岩藻聚糖酶的鉴定
从Lentimonas spp. 和北极中洋脊（AMOR）热液喷口宏基因组中筛选并重组表达了七个推测的岩藻聚糖酶。使用温和提取的巨藻岩藻聚糖作为底物进行筛选，通过流变学、尺寸排阻色谱、C-PAGE和还原末端测定等多种方法综合分析，确认了其中六个酶（Fp277.23， Fp277.50， FunA21， FunA30， AMOR639， AMOR987）具有降解活性。这些酶表现出不同的反应速率和作用模式，多数呈现典型的内切酶作用特征，即快速降低底物分子量。这是首次对来自专性降解菌Lentimonas和深海热液环境宏基因组的岩藻聚糖修饰酶进行表征。
3.4. 使用P5AFcnA对巨藻岩藻聚糖进行酶学表征
由于GH107家族酶P5AFcnA表现出最高的降解效率，被选中用于对巨藻岩藻聚糖进行深入的结构表征。质谱分析显示，降解产物包括1至8个聚合度的硫酸化岩藻糖寡糖，最终主要积累两种带有五或六个硫酸酯的硫酸化四聚体以及一个岩藻糖-2,4-二硫酸单体。通过醇沉淀分离高分子量和低分子量组分并进行成分分析，发现低分子量组分富含岩藻糖，而高分子量组分中非岩藻糖单糖（特别是半乳糖）比例显著增加。这表明巨藻岩藻聚糖由可被岩藻聚糖酶水解的硫酸化岩藻糖部分和对酶不敏感的岩藻半乳糖部分共同组成。时间分辨的尺寸排阻色谱和核磁共振分析进一步揭示了P5AFcnA以内切模式解聚岩藻聚糖的动力学过程，并鉴定出最终两种主要四聚体产物的精细结构，证实了巨藻岩藻聚糖是一种带有支链的α-1,3-连接的岩藻聚糖。
本研究得出结论：温和的提取方法对于获取保持天然结构特征的岩藻聚糖至关重要，这为后续成功的酶发现和表征奠定了基础。研究鉴定出的六个新型岩藻聚糖酶（分属GH107和GH168家族）扩展了用于岩藻聚糖加工和结构解析的酶工具箱。通过对P5AFcnA酶解产物的深入分析，首次提供了巨藻岩藻聚糖分子结构的详细图谱，揭示其由可被特异性内切酶水解的硫酸化岩藻糖主链区域和对酶不敏感、富含半乳糖的区域共同组成的复杂结构。尤为重要的是，文章在回顾该领域命名历史与混乱现状的基础上，明确提出了标准化的术语体系，建议使用“岩藻聚糖（fucoidan）”作为含岩藻糖硫酸化多糖（FCSPs）的通用术语，并区分了“硫酸化岩藻聚糖（sulfated fucan）”和“严格意义上的岩藻聚糖（sensus stricto fucoidans）”。这项工作不仅增进了对岩藻聚糖在碳循环中作用的理解，也为将其开发为功能材料和治疗剂提供了新的酶学工具和清晰的概念框架，对推动整个领域的规范化发展具有重要价值。
