《Algal Research》：Analysis of autofluorescence using full-spectrum cytometry to discriminate and monitor microalgae and bacteria
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本研究针对传统微藻色素分析方法缺乏单细胞分辨率的局限，采用了全谱流式细胞术、成像流式细胞术与细胞分选技术。研究人员系统分析了主要微藻类群及102株绿藻门菌株的光谱与形态多样性，揭示了不同藻类群体独特的自发荧光光谱特征。研究成功利用光谱信息区分了含藻胆蛋白的类群，并发现其自发荧光谱会受共存的细菌影响。该技术为微生物生态学、环境监测和生物技术应用提供了高效的细胞色素组成、生理状态与结构多样性分析新方法。
在广阔的水域中，生活着一群微小的“绿色工厂”——微藻，它们是生态系统初级生产的关键角色，也对生物地球化学循环至关重要。长期以来，科学家们依赖藻类色素作为区分不同类群的“指纹”，因为不同的色素组合反映了它们的进化历史和对环境的适应策略。然而，这一方法面临着一个根本性挑战：许多不同物种的色素谱存在重叠，单纯依靠传统的色素分析技术，例如高效液相色谱法，难以进行精确的区分。更重要的是，这些方法通常只能得到整个藻类群体的平均数据，无法窥见每个细胞的独特状态，而细胞间的差异恰恰可能隐藏着关于生长、应激或与细菌互作等重要信息。此外，常规流式细胞术虽然高通量，但检测通道有限，缺乏足够的光谱分辨率来辨别关系密切的物种。因此，亟需一种能够同时实现高通量、高分辨率和单细胞精度的分析工具，来揭示微藻群体内部隐藏的多样性和动态变化。
为了应对上述挑战，一项发表在《Algal Research》的研究提出并验证了全谱流式细胞术这一强大工具。研究人员来自哈萨克斯坦纳扎尔巴耶夫大学等单位，包括Ayagoz Meirkhanova、Sabina Marks、Damir Ussibaliyev、Aizada Bexeitova、Stella A. Berger、Michael Melkonian、Ivan A. Vorobjev和Natasha S. Barteneva。他们利用这项技术，对微藻的色素组成、分类差异和生理变异性进行了深入的探索。该研究的主要目标是：比较主要微藻类群的光谱特征，评估辅助色素在分类鉴别中的作用；考察绿藻门团藻目内的光谱变异性；评估光谱变异与形态之间的关系；并探究光谱流式细胞术在高通量微生物表征中的更广泛应用潜力。
为了完成这些目标，研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：首先，他们使用了配备七种激光的ID7000?光谱细胞分析仪进行全光谱分析，能够捕获320-808纳米激发波长下的完整发射光谱。其次，利用ImageStreamX Mark II成像流式细胞仪对细胞进行形态学分析，同步获取细胞的图像和光谱信息。再者，通过MA900细胞分选仪，根据特定的自发荧光特征对目标细胞亚群进行物理分选，以便进一步研究。最后，所有光谱数据在RStudio中进行处理和分析，运用了主成分分析(PCA)、k-means聚类等多元统计方法来揭示数据中的模式。研究所用的藻类菌株主要来自德国杜伊斯堡-埃森大学的中央藻类培养物保藏中心(CCAC)和莱布尼茨淡水生态与内陆渔业研究所。
3.1. 藻胆蛋白驱动的微藻自发荧光变异性
研究人员首先分析了来自九个主要微藻类群的32个代表性菌株的自发荧光光谱。他们发现，藻类光谱特征的一个主要区别在于是否含有藻胆蛋白(PBPs)。含有PBPs的类群（如蓝细菌、隐藻、红藻和灰藻）在约570-600纳米范围内表现出显著的荧光信号，这对应于藻蓝蛋白和藻红蛋白的发射峰。而不含PBPs的类群（如绿藻、硅藻、定鞭藻、裸藻和甲藻）的荧光则主要集中在叶绿素区域（650–720纳米）。通过计算特定光谱区域的荧光强度比值，研究发现R2/R3（约566–647纳米与约647–712纳米之比）和R2/R1（约566–647纳米与约494–566纳米之比）这两个比值能可靠地区分含PBP和不含PBP的类群，这表明与PBP相关的光谱区域是该类群的一个显著鉴别特征。
3.2. 团藻目的光谱变异性
为了探究更低分类层级的光谱异质性，研究聚焦于绿藻门下的团藻目，分析了102个菌株。计算变异系数(CV)发现，在R1（约494–566纳米）和R2（约566–647纳米）区域（与辅助色素相关）的光谱变异性显著高于R3（叶绿素区域，约647–712纳米）。对561纳米激光激发的响应尤其多变。通过主成分分析(PCA)和k-means聚类，研究人员在团藻目内识别出三个明显不同的光谱簇。成像流式细胞术分析进一步揭示，这些光谱簇的差异与细胞形态（如大小和形状）有关，例如光谱簇3的细胞平均面积最大，荧光强度也最高。
3.3. 单一纯培养物内多个自发荧光群体的鉴定
研究进一步发现，即使在单一藻株的纯培养物内部，也存在着基于自发荧光的显著异质性。以Chlamydomonassp. (CCAC 2145)为例，通过结合虚拟滤光片设置、细胞分选和成像分析，鉴定出多达五个不同的自发荧光亚群（A1, A2, B, C, D）。其中，A1和A2亚群在叶绿素区域有强荧光，但A2在400–650纳米范围荧光升高，成像显示A2主要由分裂细胞组成。而B、C、D亚群则显示出叶绿素荧光逐渐减弱，并在400–550纳米和570–640纳米区域发射增强，暗示其可能处于生理应激状态。这证明自发荧光可以揭示培养物内与细胞分裂状态、形态或代谢活动相关的细微生理差异。Chlamydomonas sp. (CCAC 2145)培养物中多个自发荧光亚群的鉴定。">
3.4. 用于监测色素生物合成和微生物关联的光谱自发荧光
研究还探索了光谱自发荧光与生理状态的关系。对Haematococcussp.（雨生红球藻）的分析显示，处于胁迫状态（红色阶段，积累虾青素）的培养物与正常生长（绿色阶段）的培养物相比，在561纳米激发下，约566–625纳米范围内的荧光强度显著增加。这表明光谱技术能敏感地捕捉到色素状态的转变。此外，对比Gonium pectorale（盘藻）的带菌培养和无菌培养，发现带菌培养物的光谱特征发生了改变，提示宿主与细菌的互作可能影响其自发荧光特性。对色素细菌Serratia marcescens（粘质沙雷氏菌）的时序监测也发现，在固体培养基上生长约9小时后，其光谱在488纳米和561纳米激发下出现明显变化，在约570纳米处出现一个明显的发射峰，这很可能与细菌色素灵菌红素的生物合成积累有关。Haematococcus sp. CCAC 3319培养物的光谱自发荧光变化。">S. marcescens在固体培养基上生长15小时的时间进程光谱分析。">
这项研究通过系统的光谱分析得出结论：全谱流式细胞术是一种强大的工具，能够基于微藻和微生物的色素组成，特别是与藻胆蛋白和类胡萝卜素相关的光谱区域，对不同类群进行区分。该方法将荧光强度变化、叶绿素峰形以及辅助色素相关光谱区域的差异与细胞的多样性及其生理状态联系起来。结合自发荧光分选和成像流式细胞术证实，具有不同形态特征（如形状和大小）的细胞表现出不同的光谱特征。研究还证明，自发荧光不仅能作为分类学标记，还能指示培养物内细胞的生理状态和代谢异质性，甚至可以监测微生物色素的生物合成过程。
其重要意义在于，这项技术为微生物生态学、环境监测和生物技术应用开辟了新的途径。在工业规模的微藻培养中，实时检测早期胁迫信号有助于优化生物质生产。与传统的群体平均测量方法不同，单细胞全谱分析能够揭示被掩盖的种群异质性，有助于筛选具有改良表型（如更高产率、更强胁迫耐受性）的细胞，从而推动基于微藻的生物制造过程优化。未来的研究应致力于扩充不同微藻和细菌类群的光谱数据库，并将光谱细胞术与单细胞成像及分选更紧密地结合，以进一步深化对微生物世界复杂性的理解。
