《Aquaculture Reports》：Culture-dependent and -independent analysis of bacterial diversity in biofloc-based aquaculture systems enriched with homemade formulation of probiotics
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为解决水产养殖中细菌性疾病频发与抗生素滥用导致的耐药性问题，本研究结合培养依赖法与16S rRNA宏基因组学，系统解析了生物絮团（Biofloc）系统中自制与商品化益生菌、养殖水体及鱼类肠道（尼罗罗非鱼与刺鲶）的微生物群落结构，并评估了其抗生素耐药性。结果表明，生物絮团水体具有更高的微生物多样性，且益生菌中富集了多种潜在益生菌属（如 Bacillus、Lactobacillus），但同时也检测到多重耐药菌株。该研究为优化生物絮团技术、开发安全益生菌制剂及控制抗生素耐药性传播提供了重要微生物学依据。
随着全球人口增长与食物需求上升，水产养殖业已成为保障优质动物蛋白供应、提升营养与粮食安全的关键产业。预计到2030年，水产食品产量将进一步增长15%，主要依靠集约化与可持续水产养殖的扩张。然而，这一行业的预期发展面临着诸多严峻挑战：由病原微生物引起的不可预测的死亡、疾病预测与控制的难题，以及日益突出的抗生素耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）问题。在集约化养殖中，细菌性疾病是制约生物生产的主要因素之一。抗生素虽常被用于对抗此类疾病，但由于其易于在鱼体组织中生物累积和残留，对消费者和环境构成潜在风险。更为棘手的是，抗生素的广泛使用已导致耐药细菌的出现。
传统的解决路径遭遇瓶颈，促使水产养殖业探索并采用既有效又环境友好、可持续的新方法。在此背景下，生物絮团技术（Biofloc technology, BFT）和益生菌（Probiotics）因其在促进可持续水产养殖目标方面的潜力而受到广泛关注。生物絮团养殖依赖于微生物的原位生产，这些微生物能维持水质、产生微生物蛋白、降低饲料转化率、减少饲料成本，并竞争性抑制潜在病原体。与此同时，益生菌作为可食用的活微生物，通过改善宿主肠道内微生物平衡来促进健康，已成为替代化学品和抗生素进行疾病控制的环保有效选择。
那么，当我们将外源益生菌添加到生物絮团系统中，期望获得“1+1>2”的协同效益时，系统内的微生物世界究竟发生了什么变化？这些添加的益生菌与系统内固有的微生物群落如何互动？它们能否成功定植于养殖鱼类的肠道，发挥益生作用？更重要的是，在这个复杂的微生物生态系统中，是否存在抗生素耐药菌的潜在风险？为了回答这些问题，来自孟加拉国达卡大学渔业系水产动物健康组的研究团队开展了一项深入研究。
这项题为《基于培养依赖与非依赖方法分析富含自制益生菌配方的生物絮团水产养殖系统中的细菌多样性》的研究，于《Aquaculture Reports》期刊发表。研究人员采用了培养依赖法（传统分离培养与16S rRNA基因测序）与培养独立法（16S rRNA宏基因组学）相结合的策略，对来自孟加拉国诺阿卡利地区两个商业化生物絮团养殖场的样本进行了全面分析。样本涵盖两大类：一是投入品，包括两种商品化益生菌（粉末状）和两种养殖场自制的液体益生菌（以未抛光米、红糖、盐和水发酵制成）；二是系统内环境与生物样本，包括生物絮团养殖水体，以及分别从生物絮团系统和传统池塘系统中采集的尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）和刺鲶（Heteropneustes fossilis，当地称Shing）的肠道内容物。研究旨在系统比较不同样本中的细菌群落，并测定分离菌株对15种常用抗生素的耐药性模式。
为全面刻画微生物群落，研究人员运用了多项关键技术。首先，通过培养依赖方法，使用Bacillus Agar（BA）、deMan, Rogosa and Sharpe（MRS）agar和Thiosulphate Citrate Bile Salts Sucrose（TCBS）agar三种培养基从各样本中分离细菌，并通过16S rRNA基因测序进行物种鉴定。其次，采用培养独立的16S rRNA宏基因组学技术，对12个样本的总DNA进行提取，针对16S rRNA基因的V4区进行扩增，并在Illumina NovaSeq 6000平台上进行高通量测序，随后利用QIIME2等生物信息学工具进行数据分析，包括α多样性（如Observed_ASVs, Chao1, Shannon, Simpson指数）、β多样性（如主坐标分析PCoA）、物种组成分析和线性判别分析（LEfSe）等。此外，还利用PICRUSt软件对微生物群落的功能潜能进行了预测。最后，通过Kirby-Bauer纸片扩散法，对分离得到的代表性细菌菌株进行了抗菌药物敏感性试验，并计算了多重抗生素耐药（MAR）指数。
3. 结果
3.1. 通过培养依赖的16S rRNA基因测序进行细菌鉴定
共从不同样本中分离出37株细菌，经16S rRNA基因测序确认了33株。芽孢杆菌属（Bacillus）是最主要的菌属，其中以枯草芽孢杆菌（B. subtilis）最为常见。商品化益生菌中富含芽孢杆菌属菌种（如B. pseudomycoides, B. amyloliquefaciens）；自制益生菌中则除芽孢杆菌属外，还发现了海洋芽孢杆菌（Oceanobacillus kimchi）、霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）和溶血不动杆菌（Acinetobacter haemolyticus）。生物絮团水体样本中分离到的细菌全部属于芽孢杆菌属，包括苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）、炭疽芽孢杆菌（B. anthracis）等。在鱼类肠道样本中，无论是池塘还是生物絮团系统养殖的罗非鱼肠道，芽孢杆菌属均占主导地位；而在刺鲶肠道中，除了芽孢杆菌属，还分离到了粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）、鸡葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum）和金黄杆菌属（Chryseobacterium sp.）等。
3.2. 通过培养独立的16S rRNA宏基因组学分析细菌群落的多样性和分布
3.2.1. 样本类型影响微生物群落的多样性和丰富度
宏基因组测序产生了高质量数据，覆盖度超过99.5%。α多样性分析表明，生物絮团养殖水体（BFW）的微生物多样性和丰富度显著高于益生菌、生物絮团养殖鱼类（BFF）及池塘养殖鱼类（对照组）样本。主坐标分析（PCoA）显示，自制益生菌、商品化益生菌、生物絮团水体以及不同来源的鱼类肠道样本形成了各自独立的聚类，表明其微生物群落结构存在显著差异。
在门水平上，所有样本中最主要的10个门包括：变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、梭杆菌门（Fusobacteriota）、放线菌门（Actinobacteria）等。自制益生菌以变形菌门为主，而商品化益生菌以厚壁菌门占绝对优势（高达98.54%）。所有生物絮团水体样本中，变形菌门都是最优势的门。在鱼类肠道中，池塘和生物絮团养殖的罗非鱼肠道均以厚壁菌门为主；池塘养殖的刺鲶肠道以梭杆菌门（如Cetobacterium）为主，而生物絮团养殖的刺鲶肠道则转变为以变形菌门为主。
在属水平上，自制益生菌中的优势菌为醋酸杆菌属（Acetobacter），而商品化益生菌中则为赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）、科恩氏菌属（Cohnella）、芽孢杆菌属和短芽孢杆菌属（Brevibacillus）。生物絮团水体的优势菌属则与环境功能相关，如Candidatus_Aquiluna、Devosia、Thermomonas等。值得注意的是，芽孢杆菌属是罗非鱼肠道（无论养殖系统）中最优势的属。而在生物絮团养殖的刺鲶肠道中，乳杆菌属（Lactobacillus）、肠杆菌属（Enterobacter）、伯克霍尔德菌属（Burkholderia）、Cavalleronia和双歧杆菌属（Bifidobacterium）等具有益生潜力的菌属显著富集。SIMPER分析和LEfSe分析进一步揭示了生物絮团水体与鱼类肠道样本在特定菌属组成上的显著差异。
3.2.2. 基因功能预测分析
通过PICRUSt对微生物群落功能基因的预测显示，不同样本的微生物群落具有不同的功能潜能。例如，自制益生菌样本中与转座酶、复制重组、辅酶转运代谢相关的基因高表达；商品化益生菌样本中与无机离子转运代谢相关的基因突出；生物絮团水体样本则富含与脱氧糖生物合成、细胞膜生物合成相关的基因。
3.3. 所研究细菌分离株的抗生素敏感性模式
对27株代表性细菌分离株进行了15种抗生素的敏感性测试。结果显示，70.37%（19株）的菌株对三种或以上抗生素耐药，被视为多重耐药菌。绝大多数分离株对阿莫西林（AML）、氨苄西林（AMP）、头孢他啶（CAZ）和青霉素G（P）耐药，而对阿米卡星（AK）、氯霉素（C）和庆大霉素（CN）较为敏感。特别值得注意的是，从生物絮团水体分离的一株B. paramycoides以及从生物絮团刺鲶肠道分离的Chryseobacterium sp.、B. subtilis和S. marcescens各一株，对所有15种测试抗生素均表现耐药。在15株芽孢杆菌属分离株中，13株对青霉素G和头孢他啶耐药，10株对氨苄西林耐药。
3.4. 所研究细菌分离株的多重抗生素耐药（MAR）指数
MAR指数分析表明，62.96%的分离株MAR指数>0.2，表明它们来源于抗生素污染高风险环境。相比之下，从自制益生菌中分离的6株菌MAR指数较低（0-0.26），提示其接触抗生素的历史较少。而有4株菌的MAR指数达到1，表明曾暴露于大量抗生素，耐药性极高。
4. 讨论与结论
本研究通过培养与非培养方法的结合，全面描绘了生物絮团系统及其添加益生菌中的复杂微生物图谱。研究表明，生物絮团养殖水体本身就是一个微生物多样性和丰富度极高的生态系统，其群落结构与添加的益生菌及鱼类肠道菌群均存在显著差异。商品化益生菌以厚壁菌门（尤其是芽孢杆菌属）为主，而自制益生菌则以变形菌门为主，且含有更多样的菌属，这提示自制发酵过程可能促进了更复杂的微生物群落形成。
一个关键的发现是，虽然养殖水体与鱼类肠道菌群在整体组成上差异显著，但在生物絮团养殖的刺鲶肠道中，确实发现了乳杆菌属、肠杆菌属、伯克霍尔德菌属等具有益生潜力的菌属的富集，这为益生菌通过生物絮团系统间接影响宿主健康提供了证据。然而，研究也同时敲响了警钟：在生物絮团水体和养殖鱼类肠道中均检测到了多重耐药细菌，甚至存在对测试所有抗生素均耐药的“超级耐药”菌株。这些耐药菌主要对β-内酰胺类抗生素（如青霉素、头孢菌素）耐药，这可能与该类抗生素在水产养殖中的历史使用有关。
综上所述，该研究不仅增进了我们对生物絮团系统微生物生态的理解，也为优化益生菌应用策略提供了科学依据。它强调，在利用益生菌增强生物絮团系统效益的同时，必须高度重视并监测系统中抗生素耐药性的产生与传播。自制益生菌虽然菌群组成不同，但其分离株的抗生素耐药性较低，提示或具有一定安全性优势，但其实际益生效果需要进一步验证。未来研究需深入探讨特定益生菌株在生物絮团系统中的定殖规律、功能机制，并建立更完善的耐药性监测体系，以真正实现水产养殖的绿色、健康与可持续发展。
