人源长链非编码RNA RMRP与DEAD-box解旋酶的相互作用及其对线粒体功能的调控

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Human lncRNA RMRP interacts with DEAD-box helicases and modulates mitochondrial function

本文系统阐释了长链非编码RNA（lncRNA）RMRP的结构动态、相互作用蛋白网络及其调控线粒体功能的新机制。研究发现，RMRP的构象具有Mg2+依赖性变化，并揭示了其与DDX5及DDX3X两种DEAD-box RNA解旋酶的直接互作，二者对于RMRP的线粒体定位至关重要。RMRP通过调控DNAJC11、NDUFS8等核编码线粒体蛋白的表达来维持线粒体稳态，其功能缺失导致线粒体膜电位下降和活性氧（ROS）水平升高。这些发现将RMRP的动态结构、蛋白互作与其在软骨-毛发发育不全（CHH）及癌症中的病理作用联系起来，为理解相关疾病的分子机制提供了新视角。

　　

RMRP的结构表征与Mg²⁺依赖性构象变化

研究者利用小角X射线散射（SAXS）技术，在溶液中解析了人源长链非编码RNA RMRP的三维结构。研究揭示，RMRP的构象高度依赖于镁离子（Mg²⁺）浓度。在5 mM Mg²⁺条件下，RMRP呈现为伸展的Y形结构，最大尺寸约为230 ?。而当Mg²⁺浓度升高至20 mM时，其结构变得更为紧凑，最大尺寸收缩至180 ?，并显示出特征性的凸起。这种Mg²⁺诱导的结构转变表明RMRP具有显著的构象可塑性，可能作为其响应细胞生理环境变化、调节与不同蛋白伙伴相互作用的分子基础。计算建模生成的三级结构模型进一步显示，在不同Mg²⁺条件下，RMRP与RNase MRP复合物蛋白组分RPP20–RPP25的结合区域均保持溶剂可及性，提示该区域在功能上的重要性。

RMRP的细胞表达谱与蛋白互作网络

通过对多种人源细胞系的定量分析，研究发现RMRP的表达水平存在显著差异，其中转移性前列腺癌细胞系PC-3 M的表达量最高。以此细胞系为模型，通过RNA pull-down结合质谱分析，鉴定了与RMRP相互作用的蛋白质网络。基因本体（GO）富集分析显示，这些互作蛋白显著富集于核糖体生物合成、RNA调控与剪接以及氧化磷酸化等通路。值得注意的是，研究首次鉴定出DEAD-box RNA解旋酶DDX5和DDX3X为RMRP的直接结合伙伴。STRING蛋白互作网络分析进一步表明，DDX5和DDX3X与已知的RMRP结合蛋白ELAVL1（HuR）及GRSF1存在关联，形成了一个复杂的调控网络。

DDX5与DDX3X对RMRP的结合特性与解旋活性

研究通过微量热泳动（MST）和电泳迁移率变动分析（EMSA）对RMRP与两种解旋酶的相互作用进行了定量表征。DDX5与RMRP表现出高亲和力结合，解离常数（K_D）为1.38 ± 0.44 μM；而DDX3X与RMRP的结合亲和力相对较弱，K_D为7.06 ± 2.49 μM。功能上，DDX5对RMRP展现出强烈的ATP依赖性解旋酶活性，能够有效解开RMRP的双链区域。相比之下，DDX3X在相同实验条件下对RMRP的解旋活性非常微弱。这表明两者虽同为DEAD-box解旋酶，但在与RMRP的互作中可能扮演着不同的角色：DDX5可能通过其解旋活性主动重塑RMRP的二级结构，而DDX3X可能更多地作为结合伙伴，参与稳定RMRP的特定构象或辅助其形成核糖核蛋白复合物。

RMRP与解旋酶之间的表达调控网络

为了厘清RMRP、DDX3X和DDX5之间的调控关系，研究团队进行了靶向敲低实验。结果发现了一个复杂的相互调控网络：敲低RMRP会导致DDX5和HuR的表达水平显著下降，而对DDX3X的表达影响不大。相反，敲低DDX3X则会大幅降低RMRP和DDX5的表达量，表明DDX3X是维持RMRP正常表达的关键上游调节因子。有趣的是，敲低DDX5并未显著影响RMRP的表达，但会引发DDX3X、HuR和GRSF1的表达补偿性上调。这些数据共同描绘了一幅图景：DDX3X是调控RMRP表达的核心，而DDX5、HuR和GRSF1则构成了一个相互关联的系统，共同通过直接相互作用来调节RMRP的功能。

DDX5与DDX3X调控RMRP的亚细胞定位

RMRP已知在细胞核和线粒体中均有功能。荧光原位杂交（FISH）实验结合线粒体荧光标记显示，在对照细胞中，RMRP同时定位于细胞核和线粒体。然而，敲低DDX5或DDX3X均会显著削弱RMRP的线粒体定位，而其核内信号则相对保留。定量分析线粒体组分中的RMRP RNA水平进一步证实了这一发现：敲低DDX3X使线粒体RMRP含量降至对照的约50%，而敲低DDX5则导致更严重的下降，降至约25%。值得注意的是，敲低DDX3X还伴随着线粒体形态的碎片化和分散。这些结果首次证明，尽管DDX5和DDX3X与RMRP的结合特性和酶活不同，但两者对于RMRP的正确定位至线粒体都是必需的，提示它们可能协同或依次作用，促进RMRP形成适合线粒体输入或与GRSF1识别的构象。

RMRP缺失损害线粒体功能

研究直接探究了敲低RMRP对线粒体稳态的功能性后果。形态学观察发现，RMRP缺失导致线粒体网络变得更加碎片化和分散。功能检测显示，RMRP敲低细胞的线粒体膜电位显著降低，同时细胞总活性氧（ROS）和线粒体特异性ROS水平均显著升高。这一现象通过JC-1和TMRM两种膜电位探针得到了相互验证。然而，在这种线粒体功能受损的情况下，细胞的凋亡（Caspase 3/7活性）和增殖能力（BrdU掺入）并未受到显著影响，表明PC-3 M细胞能够在一定时间内适应由RMRP缺失引发的代谢压力。

RMRP调控核编码线粒体蛋白的表达

为了从机制上解释观察到的线粒体功能障碍，研究检测了RMRP敲低对特定线粒体相关基因表达的影响。结果显示，RMRP的缺失选择性地下调了DNAJC11和NDUFS8的表达，而对ATP5PO和线粒体DNA编码的MT-CO₂则无显著影响。DNAJC11是线粒体接触位点及嵴组织系统（MICOS）复合体的组分，对维持线粒体嵴的正常形态至关重要。NDUFS8则是呼吸链复合体I（NADH:泛醌氧化还原酶）的一个铁硫蛋白亚基。这两个关键蛋白的下调，直接为RMRP缺失导致的线粒体形态异常、膜电位丧失和ROS升高提供了分子解释：DNAJC11减少损害了嵴结构，进而可能影响呼吸链超复合体的组装；NDUFS8的减少则直接削弱了复合体I的功能。

RMRP缺失选择性影响氧化磷酸化复合体组装

通过蓝色原生凝胶电泳（BN-PAGE）分析分离的线粒体中氧化磷酸化（OXPHOS）复合体的组装状态，研究发现RMRP缺失对各复合体的影响程度不同。其中，复合体IV（细胞色素c氧化酶）的丰度出现了最显著的下调（约降低32%），而复合体V（ATP合酶）则完全未受影响。复合体IV是呼吸链的末端酶，对维持质子梯度和膜电位至关重要。其组装受损很可能是导致膜电位下降的主要原因。研究推测，DNAJC11介导的嵴结构破坏可能特别影响了对膜环境敏感的复合体IV的组装与稳定性，这为表型提供了更精细的机制关联。

RMRP缺失破坏线粒体镁离子稳态

鉴于RMRP的结构对Mg²⁺高度敏感，且Mg²⁺是众多线粒体酶的关键辅因子，研究进一步探讨了RMRP功能是否影响线粒体Mg²⁺稳态。使用线粒体靶向的Mg²⁺荧光探针KM-301进行活细胞成像发现，RMRP敲低细胞的线粒体基质游离Mg²⁺水平显著降低了约37%。这一发现建立了RMRP功能与线粒体离子稳态之间的新联系。线粒体Mg²⁺水平下降可能通过多种方式加剧OXPHOS缺陷：其一，Mg²⁺是ATP合酶的必需辅因子；其二，三羧酸循环中的多个脱氢酶需要Mg²⁺；其三，线粒体核糖体的结构和功能也依赖于Mg²⁺。这形成了一个潜在的恶性循环：RMRP缺失导致线粒体Mg²⁺降低，进而损害能量代谢和蛋白合成，进一步恶化线粒体功能。同时，这也提示RMRP可能作为一种Mg²⁺感应器，其构象变化能够响应线粒体的代谢状态，从而动态调节相关基因的表达。

结论

本研究系统揭示了长链非编码RNA RMRP是一个具有Mg²⁺依赖性构象动态的多功能分子。它通过直接结合DDX5和DDX3X两种DEAD-box RNA解旋酶，并在后者的协助下定位于线粒体，进而通过调控DNAJC11、NDUFS8等核编码基因的表达，在维持线粒体膜电位、ROS平衡及嵴结构中发挥核心作用。RMRP的功能缺失会破坏线粒体Mg²⁺稳态和OXPHOS复合体组装，尤其影响复合体IV。这些发现将RMRP的结构可塑性、蛋白互作网络与其在软骨-毛发发育不全（CHH）及癌症等疾病中的病理生理作用紧密联系起来，为深入理解相关疾病的分子机制及探索潜在治疗策略提供了新的理论基础。