《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Aging-associated differences in mammary tumor–initiating populations and immune evasion pathways in breast cancer
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本文通过整合多组学分析，系统揭示了衰老如何重塑乳腺肿瘤的起源细胞（从成熟腔上皮细胞转向衰老腔祖细胞样细胞，ALP-like）、驱动独特的基因组不稳定性（如Chr 20p LOH），并通过削弱抗原呈递能力（MHC分子表达下降）及减少T细胞浸润来构建“冷”肿瘤微环境，最终影响患者（尤其老年）的预后。该研究为理解年龄如何作为乳腺癌发生与治疗响应的关键变量提供了分子基础。
结果：年龄影响乳腺肿瘤的发生、生长动态和组织病理学特征
为了评估年龄对乳腺肿瘤发生的影响，研究团队向不同年龄（1、3、6、12或20个月大）的雌性Fischer 344大鼠注射致癌物N-亚硝基-N-甲基脲（NMU）。纵向观察发现，年龄对肿瘤发生率、生长动力学和组织病理学有显著影响。与中年组（6和12个月）相比，幼年组（1个月和3个月）和最年长组（20个月）的大鼠表现出更早的肿瘤发生时间和更高的肿瘤发生率。在肿瘤组织病理学方面，年轻动物（1个月大）的肿瘤主要是腺瘤，而老年组则出现了更多样化的恶性组织学亚型，包括腺癌和肉瘤。免疫组织化学分析显示，1月龄组的肿瘤具有较高比例的雌激素受体（ER+）、孕激素受体（PR+）和HER2+，而随着年龄增长，肿瘤逐渐向受体阴性表型转变。肿瘤免疫环境分析显示，在最年长动物（20个月）的肿瘤中，CD45+免疫细胞和CD3+T细胞的浸润显著减少。此外，老年动物的肿瘤中KRT18+腔上皮癌细胞减少，间质成分增加，提示细胞状态向更未分化的间充质样状态转变。这些发现表明，暴露于NMU时的年龄对大鼠的肿瘤起始、分子亚型和免疫微环境具有关键影响。
年龄对乳腺肿瘤转录组和突变谱的影响
通过肿瘤组织的批量RNA测序（RNA-seq），研究人员发现转录组聚类主要形成两个与年龄无关的簇：一个为“腔样”组，高表达激素受体和腔系转录因子（如FOXA1和GATA3）；另一个为“基底样”组，低表达这些基因。绝大多数来自1月龄大鼠的肿瘤属于腔样簇，而所有来自12月和20月龄组的肿瘤均属于基底样簇，这展示了与人类乳腺癌亚型平行的、年龄依赖性的分子表型转变。通路富集分析表明，与细胞增殖、分化、上皮-间质转化（EMT）相关的通路（如TGF-β和NOTCH信号）以及免疫和炎症相关通路（如干扰素反应、IL2-STAT5信号）的表达随年龄增长而下调。在人类TCGA-BRCA队列的年轻患者（≤40岁）肿瘤中也观察到类似的通路富集，表明这种免疫调节和炎症通路的抑制是跨物种保守的年龄相关机制。
全外显子组测序（WES）分析发现，1月龄组的肿瘤突变负荷（TMB）显著高于其他年龄组。突变谱分析揭示了强烈的年龄依赖性变化：年轻大鼠（1和3月龄）的肿瘤中C>T转换占主导，而老年大鼠（12和20月龄）的肿瘤中C>T转换减少，C>A颠换比例增加。年轻动物的肿瘤显示出更高的转换/颠换（Ti/Tv）比率。在人类TCGA-BRCA数据中，ER阳性肿瘤同样富集C>T转换并具有更高的Ti/Tv比率，而ER阴性肿瘤则表现出更广泛的突变谱，包括增加的颠换，这表明激素状态和年龄相关的突变过程存在跨物种关联。对碱基切除修复（BER）途径活性的评估显示，在大鼠和人类中，正常乳腺上皮细胞的BER活性均随年龄增长而进行性下降，这可能导致了老年动物肿瘤中观察到的颠换增加和突变特征改变。
单细胞图谱揭示年龄依赖性的乳腺肿瘤进化路径
通过对不同年龄大鼠肿瘤进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），研究人员鉴定了八个主要细胞群：癌症上皮细胞（包括腔祖细胞样、成熟腔细胞样和基底样亚群）、基质细胞（癌症相关成纤维细胞，CAFs）、内皮细胞、周细胞和免疫细胞（髓系样细胞、T/NK淋巴细胞）。年龄依赖性分布模式分析显示，在最老年动物（20月龄）的肿瘤中，成熟腔样和基底样肿瘤上皮细胞显著减少，而基质区室（特别是内皮细胞和CAFs）明显扩张。为了识别年龄依赖性转录变化，研究人员对每个主要细胞群体进行了差异基因表达分析。在所有细胞类型中，癌症上皮细胞（尤其是腔祖细胞样和基底样群体）表现出最高数量的差异表达基因，表明上皮肿瘤细胞对年龄驱动的分子差异特别敏感。对随年龄增长而上调的基因进行基因本体分析发现，在腔祖细胞样细胞中，涉及类固醇和脂肪酸反应的通路被激活；在基底样细胞中，细胞迁移、粘附和上皮分化通路富集。相反，在包括上皮细胞、CAFs和髓系细胞在内的多种细胞类型中，最一致下调的通路与抗原加工和呈递有关。此外，T/NK细胞和髓系细胞中的免疫细胞活化通路均减弱，突显了衰老肿瘤微环境中免疫功能普遍受到抑制。
衰老相关的乳腺肿瘤免疫微环境变化
对T细胞的进一步分析显示，与年轻对照组（1月龄）相比，20月龄大鼠肿瘤中浸润的T细胞（尤其是CD8+T细胞群）显著减少。基因集富集分析表明，CD4+和CD8+T细胞中干扰素α和γ反应通路的活性随年龄增长而显著下降。髓系细胞亚群分析发现，总髓系细胞数量随年龄下降，尤其是在Cd163+肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、1型树突状细胞（DC1）、2型树突状细胞（DC2）中。一个独特的“衰老-单核-巨噬细胞”群体仅出现在老年大鼠的肿瘤中。关键的髓系细胞功能——抗原呈递能力随年龄增长而下降，在大鼠MHC II类（RT-1B, RT-1D）和I类分子β2-微球蛋白（B2M）的表达降低上得到体现。流式细胞术验证了这些变化，证实了DC1、DC2和TAMs中MHC II类分子和B2M的表达呈年龄依赖性显著降低。相关性分析进一步显示，DC1、DC2和组织巨噬细胞中更高的RT-1D和B2M表达与TCRα/β+总T细胞、CD4+和CD8α+T细胞的存在呈正相关。基质细胞分析发现，肿瘤中总基质细胞数量随年龄逐渐增加，尤其是炎性癌症相关成纤维细胞（iCAFs）和毛细血管内皮细胞。同时，识别出一个独特的“衰老-iCAF”亚群。尽管数量扩张，但基质细胞也表现出抗原加工和呈递通路活性的降低，与髓系细胞的缺陷相呼应。这些单细胞数据共同揭示，衰老协调了上皮、基质和免疫的重塑，伴随着抗原呈递和炎症信号的钝化，同时驱动基质和血管变化，最终形成了老年宿主中“冷”的、促纤维化的肿瘤表型。
年龄依赖性的癌症上皮异质性与分子进化
通过对肿瘤上皮细胞进行高分辨率亚聚类分析，发现了多个离散的亚群，包括经典的腔祖细胞样、成熟腔细胞样、基底样癌细胞、一个中间亚型，以及一个仅出现在老年动物肿瘤中的、具有独特转录特征的腔祖细胞样子集，研究人员将其命名为“衰老腔祖细胞样”细胞。伪时间轨迹分析显示，年轻大鼠的肿瘤主要富集成熟腔样上皮细胞，中年大鼠的肿瘤则表现为成熟腔样和腔祖细胞样细胞的混合，而老年大鼠的肿瘤则不成比例地富集衰老腔祖细胞样细胞。UMAP投影显示，衰老腔祖细胞样癌细胞与老年大鼠正常乳腺中的衰老腔祖细胞高度重叠，进一步支持了衰老腔祖细胞可能是老年动物肿瘤的潜在起源细胞的假说。此外，在人类转移性乳腺癌患者中，衰老腔祖细胞样特征表达较高的患者总生存期显著缩短。最重要的是，在METABRIC数据集和整合的人类乳腺癌图谱中，衰老腔祖细胞样细胞特征在三阴性乳腺癌（TNBC）中的表达也显著高于非TNBC肿瘤，表明衰老腔祖细胞样癌细胞是人类TNBC的主要细胞状态。
对衰老腔祖细胞样与经典腔祖细胞样癌细胞之间的差异表达分析及基因集富集分析显示，衰老腔祖细胞样细胞的特征是免疫反应和炎症相关基因集（包括干扰素和炎症反应）的显著下调。相反，氧化磷酸化相关基因集在衰老腔祖细胞样细胞中明显上调。为了探索这些变化如何从正常乳腺演变至肿瘤，研究人员整合了正常乳腺和NMU诱导肿瘤的单细胞RNA测序数据集。分析发现，在肿瘤进展过程中，上皮细胞群发生了戏剧性扩张，并伴随广泛的转录重组。衰老腔祖细胞样癌细胞的分布与老年大鼠正常衰老腔祖细胞高度重叠。对衰老腔祖细胞样癌细胞与正常衰老腔祖细胞基因表达谱的比较揭示了171个显著上调和487个显著下调的基因。基因本体分析表明，上调基因富集于上皮细胞分化和生长因子反应通路，与细胞转化和增殖状态一致；下调基因主要富集于白细胞粘附、T细胞活化和MHC蛋白复合物组装。这表明从衰老腔祖细胞向衰老腔祖细胞样细胞的转变与免疫逃逸相关，并促成了在老年大鼠乳腺肿瘤中观察到的免疫抑制性肿瘤微环境。
年龄依赖性的染色体改变与乳腺肿瘤中的抗原呈递
通过对癌症上皮细胞进行inferCNV分析，检测了全基因组的拷贝数改变，揭示了年龄相关的染色体畸变模式和程度差异。年轻大鼠（1和6月龄）的肿瘤表现出相对局灶性的增益和缺失，而老年动物（12和20月龄）的肿瘤则显示出更广泛的染色体不稳定性。基于inferCNV数据生成的克隆进化树进一步突显了这种与年龄相关的基因组差异。值得注意的是，7q号染色体的增益在所有年龄组中反复出现，而14p号染色体的增益在腔祖细胞样细胞中主要见于老年大鼠的肿瘤。20p号染色体的杂合性缺失（LOH）在腔祖细胞样细胞中随年龄增长而增加，表明衰老与乳腺肿瘤基因组不稳定性的增加相关。对正常大鼠乳腺上皮细胞的分析也观察到了类似的年龄相关拷贝数改变，包括老年大鼠衰老腔祖细胞中14p号染色体的增益和20p号染色体的杂合性缺失。
基因表达分析显示，与腔祖细胞样细胞和正常腔祖细胞相比，衰老腔祖细胞样肿瘤细胞和正常衰老腔祖细胞中位于20p号染色体杂合性缺失区域的基因表达沉默。基因本体富集分析揭示这些基因主要参与抗原加工、呈递和适应性免疫反应。全外显子组测序数据进一步证实了20月龄大鼠肿瘤中存在20p号染色体杂合性缺失。平行进行的免疫荧光和流式细胞术分析显示，MHC I类分子（B2M）的表达呈年龄相关性下降，老年大鼠的肿瘤中MHC II+细胞频率降低。相关性分析表明，肿瘤上皮细胞中B2M的表达与T细胞及其CD4/CD8谱系的浸润呈正相关，表明抗原呈递减弱可能直接损害肿瘤微环境内的T细胞募集。
最后，为了探索临床相关性，研究人员利用METABRIC队列的拷贝数和转录组数据分析了人类6p号染色体（大鼠20p号染色体的同源区域）。更高的6p号染色体缺失水平与更低的基因表达相关，且基因表达随年龄增长而下降，并与肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）数量呈正相关。这些结果在TCGA-BRCA和POG570数据集中得到了一致验证。此外，具有更高6p号染色体缺失的患者其无复发生存期显著缩短。当仅基于6p号染色体区域内的抗原加工和呈递相关基因对患者进行分层时，对于TIL丰度和生存结局观察到了更清晰的趋势。这些发现共同揭示了乳腺肿瘤中染色体改变与免疫识别的协调性年龄差异。老年动物肿瘤中染色体畸变的增加和抗原呈递分子表达的减少共同促成了免疫逃逸表型，为理解可能影响治疗抵抗的年龄相关免疫逃逸提供了分子见解。
讨论
衰老是癌症生物学的一个关键调节因素，但其对乳腺肿瘤分子和细胞进化的精确影响仍未完全明了。本研究利用NMU诱导的大鼠乳腺肿瘤模型，全面揭示了衰老对肿瘤起始、基因组结构、上皮层次和免疫微环境的重塑。研究发现，衰老促进了具有独特起源细胞的肿瘤发展，导致基底样或三阴性乳腺癌样表型。这些肿瘤的特征是激素受体表达减少、抗原呈递抑制和T细胞浸润减少。其背后的机制包括与DNA修复能力下降相关的基因组不稳定性增加，以及免疫逃逸增强（包括MHC I类和II类分子表达降低）。在乳腺癌患者中，6号染色体短臂上MHC区域的缺失与MHC水平降低相关。该区域的高缺失与所有亚型和年龄段患者肿瘤中更少的肿瘤浸润淋巴细胞和更短的无复发生存期相关。该模型通过捕捉与人类乳腺癌相关的年龄依赖性免疫差异，为评估治疗反应（尤其是免疫疗法）提供了一个强大的临床前平台。
研究中纳入青春期前（1月龄）大鼠，突出了乳腺致癌作用的发育易感性窗口。衰老相关的颠换突变和染色体改变增加与之前报道的年龄相关DNA修复功能障碍（包括人类研究中显示的老年乳腺癌患者结构性变异增加）相一致。观察到的T细胞浸润和干扰素反应通路的年龄相关性下降，反映了在人类乳腺癌中观察到的免疫衰老模式。数据显示，老年动物肿瘤中树突状细胞数量和MHC II类表达均减少，这与免疫衰老导致老年人癌症风险增加和免疫治疗效果较差的观点相符。单细胞图谱显示，衰老腔祖细胞样细胞是老年大鼠肿瘤中的主要癌细胞，它特异性表达衰老腔祖细胞特征。分析表明衰老腔祖细胞样细胞与人类三阴性乳腺癌共享转录程序。推断的拷贝数变异和全外显子组测序数据提示，衰老腔祖细胞样肿瘤细胞中20p号染色体区域的杂合性缺失（该区域含有抗原加工和呈递相关基因）与癌症免疫逃逸和肿瘤进展有关。研究结果表明，由于T细胞耗竭和上皮MHC缺失的综合效应，老年个体发生的肿瘤可能对抗检查点抑制剂产生抵抗，这与临床试验显示老年患者免疫治疗反应较差的观察结果一致。
然而，老年大鼠激素阴性肿瘤中MHC的缺失和肿瘤浸润淋巴细胞的减少，与一般报道的人类三阴性乳腺癌相比激素受体阳性肿瘤具有更高HLA和更多肿瘤浸润淋巴细胞形成对比，这可能反映了致癌物驱动模型与自发肿瘤模型之间的差异。大鼠模型在模拟人类6p号染色体MHC位点改变方面的保真性，为研究免疫编辑动态提供了独特机会。此外，衰老腔祖细胞样细胞作为三阴性乳腺癌治疗靶点的潜力值得探索。
虽然NMU诱导的大鼠模型为了解衰老相关的乳腺肿瘤发生机制提供了宝贵的见解，但它并未完全再现人类乳腺癌的流行病学模式，特别是随着年龄增长激素受体阳性肿瘤患病率更高的现象。这些差异可能源于使用了化学致癌物而非自发肿瘤发展、致癌物暴露时间、物种特异的内分泌调节以及啮齿动物相对于人类的压缩寿命。尽管如此，本研究确定的年龄相关改变，包括免疫组成、基因组稳定性和上皮可塑性的变化，捕捉了跨物种塑造肿瘤行为的保守生物学过程。因此，我们的发现通过揭示衰老如何重编程乳腺组织生态系统以利于特定肿瘤亚型的机制基础，补充了人类流行病学的观察结果。
通过绘制衰老对乳腺肿瘤发生的多维影响，本研究建立了一个理解免疫衰老、基因组不稳定性和上皮可塑性如何相互作用以驱动侵袭性癌症表型的框架。大鼠与人类肿瘤之间保守的分子特征突显了转化机遇，同时强调了制定针对年龄的治疗策略的必要性。重要的是，我们的年龄分层NMU诱导大鼠模型通过捕捉与人类乳腺癌相关的年龄依赖性免疫差异，为评估治疗反应（尤其是免疫疗法）提供了一个强大的临床前平台。因此，该模型为测试标准和免疫干预措施提供了一个有价值的临床前工具。
