《Biochemical Engineering Journal》：Enhancing the catalytic performance of promiscuous acyltransferases by fusion to CAHS1 protein from
Ramazzottius varieornatus
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通过将极端耐热蛋白CAHS1与两种酰基转移酶MAA和EstCE1融合，显著提升了酶的活性与稳定性，解决了酶工程中活性与稳定性的权衡难题。实验表明融合酶在酰基转移效率（kcat/Km）和长期储存活性（30天保留72.6%）方面均优于原酶，且催化葡萄糖生成6-O-脱乙酰葡萄糖的效率提高21.2%。结构分析揭示CAHS1通过动态包裹形成疏水微环境，同时扩大活性位点，协同增强酶的催化性能与抗逆性。
Zixuan Zhang|Qingjun Jia|Yufan Wei|Linling Yu|Yan Sun
中国天津市天津大学合成生物学与生物制造学院、合成生物学前沿科学中心（教育部）以及系统生物工程国家重点实验室，邮编300350
摘要
由于杂合酰基转移酶在酰基转移反应中具有水解酶活性，因此提高其酰基转移酶活性和稳定性是一个重大挑战。本文提出了一种新的融合策略，利用极端耐热且细胞质中丰富的热溶性蛋白（CAHS1）作为两种杂合酰基转移酶MAA和EstCE1的保护结构域。这种融合不仅提高了酰基转移酶的活性，还增强了其储存稳定性，从而克服了酶工程中常见的活性与稳定性之间的权衡问题。具体而言，以苯甲醇作为酰基受体、p-硝基苯基丁酸作为酰基供体时，MAA-CAHS1的酰基转移催化效率（kcat/Km）提高了2.4倍，并且在储存30天后仍保留了新鲜MAA初始活性的72.6%。此外，MAA-CAHS1将葡萄糖转化为6-O-D-乙酰葡萄糖的转化率比MAA高21.2%。结构分析表明，CAHS1的融合不仅扩大了活性位点的裂隙，还通过动态包裹保护了酶分子，从而通过创建更疏水的微环境增强了酰基转移酶的活性和稳定性。因此，本研究提供了一种通过CAHS1融合来提高杂合酰基转移酶活性和稳定性的新方法。
引言
水解酶是一大类酶，包括酯酶、脂肪酶、糖苷酶、酰胺酶和脱卤酶，在生物体的代谢过程中起着重要作用[1]。同时，由于水解酶具有高立体选择性和区域选择性、催化普适性以及不需要辅因子的特点，它们已成为工业应用中最有用的催化工具之一[2]。在生理条件下（水环境中），它们利用水作为亲核试剂来催化水解反应[3]。一些水解酶在无水条件下（干有机溶剂中）也表现出催化活性，通常是脂肪酶和酯酶，它们催化水解的逆反应[4]，[5]，即酰基转移反应（包括酯化[6]、转酯化[7]和酰胺化反应[8]等），从而为合成有价值的酯类和酰胺类提供了有效途径。特别是，近几十年来发现了一类水解酶，它们在水环境中（存在大量水的情况下）仍能保持其酰基转移酶活性[2]，[9]，从而无需使用昂贵、有毒且难以处理的有机溶剂。这类酶被称为杂合水解酶/酰基转移酶（简称杂合酰基转移酶）。因此，杂合酰基转移酶为酯类和酰胺类的合成提供了一种更环保、更可持续的替代方案。此外，与大多数需要在水环境中依赖复杂且昂贵的酰基-CoA或酰基载体蛋白作为酰基供体的酰基转移酶不同[10]，杂合酰基转移酶可以使用简单且廉价的酰基供体（如乙酸乙酯[11]、[12]、[13]），因此更适合工业合成应用。
2020年，Müller等人从VIII家族羧基酯酶中鉴定出EstCE1，这是一种多功能杂合酰基转移酶，能够在水环境中催化酯类、酰胺类、碳酸酯和尿烷的合成，在几秒钟内实现苯甲醇和乙酸乙烯酯的酯化转化率高达90%[12]。随后，Godehard等人开发了一种工程改造的EstCE1突变体（L239M/F243A/V342A，简称MAA），使用寡糖底物和乙酸乙酯或异丙基乙酯作为底物，其糖脂合成速率比EstCE1在水环境中高出20倍[13]，这克服了糖类在有机溶剂中溶解度低的问题，为亲水性底物提供了一种高效的杂合酰基转移酶。然而，这些杂合酰基转移酶在实际应用中仍存在稳定性限制[3]。尽管它们可以在水环境中催化酰基转移反应，但同时也会发生水解[2]、[3]、[9]、[12]、[14]。这表明酰基供体的酰基转移与水解之间存在动力学竞争。因此，酰基转移速率（AT）与水解速率（H）的比值（AT/H）已成为评估杂合酰基转移酶催化效率的常用参数[3]、[12]。此外，AT/H比值会随操作条件的变化而变化，这使得催化稳定性在工业酰基转移应用中尤为重要，尤其是在长时间储存的情况下。迄今为止，已经开发了许多策略来提高杂合酰基转移酶的催化稳定性[2]、[15]、[16]、[17]。保护结构域融合为稳定酶结构和活性免受各种环境压力提供了有希望的方法[18]。
最近，从缓步动物（即水熊）中发现的细胞质丰富热溶性（CAHS）蛋白被证实可以在加热和储存条件下保护脂蛋白脂肪酶和乳酸脱氢酶[19]。此外，从强耐热菌Ramazzottius varieornatus中分离出的CAHS1蛋白有助于保护细胞质蛋白在脱水条件下的稳定性，并可能作为生物分子的伴侣蛋白[20]。虽然其在无水环境中的保护作用已被证实，但其作为在水性反应介质中工作的酶的基因融合伙伴的潜在应用尚未得到充分探索。鉴于CAHS1蛋白在脱水条件下的保护作用可以保护目标蛋白，我们假设与CAHS1的融合可能为杂合酰基转移酶创造一个有利于酰基转移而非水解的有序微环境。因此，我们推测CAHS1融合可能作为保护结构域，有助于在长期储存后保持酶的活性并提高酰基转移效率（AT/H比值）。本研究将CAHS1通过柔性连接肽（简称GS4）4分别融合到两种杂合酰基转移酶EstCE1和MAA的N端或C端，并系统地研究了CAHS1融合对酶活性、动力学、稳定性以及AT/H比值的影响。随后，通过圆二色光谱和荧光光谱以及分子模拟分析了融合后酶结构的变化。最后，在水环境中进行了糖的乙酰化实验，以评估其在工业合成中的实际应用潜力。
材料
苯甲醇和p-硝基苯基丁酸（p-NPB）购自HEOWNS（天津，中国）。p-硝基苯酚（p-NP）和葡萄糖购自Aladdin（上海，中国）。乙酸乙酯购自Jiangtian Chemical Technology Co., Ltd（天津，中国）。大肠杆菌（E. coli）BL21（DE3）和E. coli Shuffle T7购自Takara（大连，中国）。pET-28a (+)表达载体购自Solarbio（北京，中国）。基因合成由GENEWIZ（苏州，中国）完成。
CAHS1融合杂合酰基转移酶的纯化和表征
CAHS1序列通过GS4连接肽与每种酶的N端和C端进行了基因融合（图S1）。然后，四种融合酶以及两种亲本杂合酰基转移酶EstCE1和MAA分别在大肠杆菌 BL21(DE3)中进行了重组表达。如图S3和S4所示，纯化的MAA和EstCE1的分子量与理论值42.0 kDa和42.1 kDa一致。然而，四种融合酶的表观分子量
结论
本研究系统探讨了来自缓步动物的IDP CAHS1融合对杂合酰基转移酶MAA和EstCE1的影响，证明了这种融合策略显著提高了它们的酰基转移活性，同时降低了水解活性。值得注意的是，酰基转移酶的活性和稳定性都得到了提升，表明这是一种有效改造杂合酶的新方法。从机制上讲，CAHS1融合创建了一个疏水的微环境
CRediT作者贡献声明
Qingjun Jia：撰写初稿、验证、方法学设计、实验研究、数据整理。Yufan Wei：数据可视化、验证、软件开发、实验研究。Linling Yu：撰写与编辑、项目监督、资源协调、资金获取、概念构思。Yan Sun：撰写与编辑、项目监督、资源协调、项目管理。Zixuan Zhang：撰写初稿、数据可视化、软件开发、方法学设计、实验研究、数据分析。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号22378306）的支持。
