NMN通过促进线粒体自噬来恢复H型血管，从而预防肥胖引起的骨质疏松症

《Biochemical Pharmacology》：NMN prevents obesity-induced osteoporosis by promoting mitophagy to restore type H vessels

肥胖性骨质疏松的血管生成-骨生成耦合机制及NMN治疗研究。高脂饮食诱导小鼠骨质疏松模型显示，NMN通过抑制Src激酶活性，促进线粒体自噬（LC3/TOMM20共定位增强，mitophagy相关基因上调），恢复型H血管（EMCN+CD31+）功能，从而改善骨密度和微结构。该机制首次阐明Src/LC3信号通路在肥胖相关骨代谢紊乱中的作用。

　　

沈梦|余新如|王俊|孙凯农|熊伟|叶莉|张倩

中国农业大学营养与健康系精准营养与食品质量重点实验室，北京100193

摘要

肥胖引起的骨质疏松症是一个日益严重的全球健康问题，需要更多的治疗策略。新的证据表明，骨特异性H型血管的减少与骨质疏松症有关，因为它们在血管生成-骨形成耦合中起着关键作用。烟酰胺单核苷酸（NMN）被认为可以改善代谢疾病，但其在肥胖引起的骨质疏松症中调节H型血管的作用尚不清楚。我们使用高脂饮食（HFD）建立了肥胖引起的骨质疏松症小鼠模型。体外实验中，用棕榈酸（PA）刺激原代骨髓间充质干细胞（BMSCs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）以模拟高脂环境。通过Micro-CT评估骨骼情况。通过划痕实验检测HUVECs的血管生成能力。通过网络药理学探索NMN恢复H型血管的潜在靶点。利用免疫荧光、Western blot和实时PCR研究信号通路。NMN通过恢复肥胖小鼠受损的H型血管，从而增强血管生成-骨形成耦合，显著抑制了HFD引起的骨质疏松症。体外实验中，NMN修复了PA引起的BMSCs和HUVECs的功能障碍，分别促进了骨形成分化和迁移能力。从机制上讲，NMN通过抑制Src激活来恢复HFD受损的线粒体自噬，并抑制肥胖引起的多胺积累。这些发现表明，NMN通过恢复H型血管和增强血管生成-骨形成耦合来预防肥胖引起的骨质疏松症，这一过程由Src/LC3信号通路和随后的线粒体自噬促进。我们的研究揭示了一种新的机制，并强调了NMN作为治疗肥胖相关骨质疏松症的有希望的治疗剂。

引言

肥胖是一个全球性的健康问题，其患病率不断上升，并与多种并发症相关，如骨质疏松症[1]。肥胖引起的骨质疏松症是由于代谢紊乱或障碍（例如慢性低度炎症、胰岛素抵抗和脂肪因子失调）引起的，其特征是骨密度降低、骨微结构受损以及骨折发生率增加[2]，[3]。据估计，到2030年，将有超过10亿人患有肥胖症[4]，这使得很大一部分人口面临更高的骨质疏松症风险。因此，肥胖相关的骨质疏松症正成为一个日益严重的公共卫生问题，从而增加了对靶向疗法研究和开发的兴趣[5]。

有证据表明，骨质疏松症与H型血管的减少或功能受损有关[6]，[7]。H型血管是骨髓中的一种毛细血管亚型[6]，其特征是内皮粘蛋白（EMCN）和血小板内皮细胞粘附分子-1（CD31）的高表达（EMCN^hi CD31^hi）[8]。H型血管与骨形成密切相关。它们通常被丰富的成骨细胞前体细胞所包围[6]，并通过分泌血管内皮生长因子（VEGF）和Noggin等因子调节成骨细胞或破骨细胞的功能[9]。同时，骨骼可以通过分泌多种因子（包括VEGF、血小板衍生生长因子BB型（PDGF-BB）和Slit导向配体3（SLIT-3）[10]，[11]来调节血管生成。多项研究表明，H型血管通过血管生成-骨形成耦合对骨质疏松症有显著影响[12]，[13]。

近年来，越来越多的研究关注肥胖个体骨骼系统中的H型血管功能。在老年骨质疏松患者和绝经后妇女中观察到骨髓脂肪增多和H型血管功能异常[14]，[15]。在卵巢切除术（OVX）和高脂饮食（HFD）诱导的骨质疏松症小鼠模型中，小鼠表现出H型血管退化，伴有明显的结构变形和血管密度降低[16]。抑制脂肪细胞中的雌激素相关受体α可以抑制骨髓脂肪细胞的形成，从而增加CD31⁺ EMCN⁺血管的强度，最终减轻骨丢失[16]。相反，骨骼发育过程中过多的脂肪积累会损害H型血管的形成[17]。这些发现表明，肥胖可能驱动骨骼中H型血管的恶化。然而，这一领域的研究仍然有限，其潜在机制尚不清楚。此外，有效的药物干预措施来缓解H型血管功能障碍仍然存在明显不足。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是氧化还原反应的关键辅酶，也是非氧化还原酶的重要辅因子，支持着重要的代谢途径[18]。值得注意的是，肥胖小鼠的多种组织类型中NAD水平下降[19]，[20]。BMSCs中NAD+的耗竭会促进脂肪生成分化，同时损害骨形成分化，可能导致骨丢失[21]。作为NAD+生物合成的关键中间体，烟酰胺单核苷酸（NMN）被广泛用于提高NAD+水平[22]。证据表明，NMN的摄入可以通过改善饮食和年龄相关的体重增加、减少脂肪组织炎症[23]，[24]以及预防骨丢失[18]，[21]来带来显著的代谢益处。此外，NMN还被报道可以促进血管生成并改善血管功能[25]，[26]，[27]。然而，NMN对改善H型血管形成的影响尚无定论。

NMN已被证明可以通过增强线粒体自噬来保护线粒体[28]。线粒体自噬功能障碍是肥胖和骨质疏松症患者常见的病理现象。最近的研究表明，Src蛋白（一种非受体酪氨酸激酶）是线粒体自噬的负调节因子[29]。例如，Src的抑制通过促进FUN14结构域包含1（FUNDC1）进入细胞线粒体来诱导线粒体自噬[30]，[31]。同样，Src的敲低可以稳定Parkin的泛素化水平，从而激活线粒体自噬[32]。值得注意的是，HFD喂养的小鼠中Src蛋白水平显著升高[33]。然而，尚不清楚Src蛋白水平的升高是否与肥胖个体的线粒体自噬或骨丢失有关。因此，本研究旨在探讨NMN是否通过抑制Src和促进线粒体自噬来改善H型血管和血管生成-骨形成耦合。

在本研究中，我们探讨了NMN是否通过恢复H型血管功能来预防肥胖引起的骨质疏松症。通过结合肥胖引起的骨质疏松症小鼠模型和棕榈酸刺激的细胞模型，我们发现NMN恢复了H型血管，增强了血管生成-骨形成耦合，并防止了骨丢失。NMN的保护作用是通过调节Src/LC3信号通路实现的，该通路成功恢复了肥胖抑制的H型血管中的线粒体自噬。这项研究突出了NMN治疗肥胖相关骨质疏松症的治疗潜力，并揭示了其保护作用背后的新病理生理机制。

部分内容摘要

动物和治疗方法

本研究采用2×2因子设计的随机对照体内纵向小鼠动物模型（饮食×处理），并进行终点组织分析。所有涉及动物的程序均获得了中国农业大学动物伦理委员会的批准（批准编号AW62904202-5-2）。4周大的雄性C57BL/6小鼠被随机分为四组：普通饮食+生理盐水、普通饮食+NMN、高脂饮食+生理盐水和高脂饮食+NMN。根据样本量计算公式，每组n = 5只

NMN改善肥胖引起的骨丢失

为了研究NMN对肥胖引起的骨质疏松症的发展和进展的影响，4周大的小鼠被喂食高脂饮食（HFD）或普通饮食12周，从10周龄开始给予NMN治疗（图1A）。HFD组的能量摄入显著增加，而在NMN治疗后保持不变（图1B）。NMN的应用部分抑制了HFD引起的体重、生殖腺白色脂肪组织（WAT）质量和总体脂肪质量的增加（图1C-1E）

讨论

本研究表明，NMN通过恢复H型血管形成和血管生成-骨形成耦合来预防肥胖相关的骨丢失。据我们所知，这是首次研究表明NMN通过调节Src/LC3信号通路来缓解线粒体自噬阻塞，从而恢复H型血管功能。研究结果还表明，肥胖会损害H型血管，可能是由于血管细胞中的线粒体自噬受损。这与之前的证据一致，表明

CRediT作者贡献声明

沈梦：撰写——初稿、方法学、研究、数据管理。余新如：撰写——初稿、方法学、正式分析。王俊：研究。孙凯农：验证、研究、正式分析。熊伟：方法学、正式分析。叶莉：方法学、正式分析。张倩：撰写——审稿与编辑、可视化、监督、项目管理、方法学、资金获取、数据管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢香港理工大学的Tiev Miller教授在编辑和修改手稿方面提供的宝贵反馈和帮助。本工作得到了河南省自然科学优秀青年学者基金（252300421132）、国家自然科学基金（82272566, 82472393）和中国农业大学2115人才发展计划的支持。