《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics》：HydSL hydrogenase of
Thiocapsa bogorovii may participate in sulfur respiration
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紫硫细菌硫呼吸中HydSL氢酶复合体的功能与作用机制研究。通过基因表达分析和蛋白复合体纯化，发现Thiocapsa bogorovii中HydSL复合体（含HydS、Isp1、Isp2、HydL亚基）在黑暗厌氧条件下显著增强硫还原活性（H2+S0→H2S），其表达与硫还原能力呈正相关。该复合体具有高热稳定性、抗CO/S2抑制特性，并可能通过跨膜定位参与质子动力势生成。基于蛋白组学、基因表达谱及电催化特性，系统论证了HydSL在硫呼吸中的核心作用，完善了NiFe氢酶分类学（ subgroup 1e）的生化功能阐释。
Makhmadyusuf Khasimov | Ekaterina P. Petushkova | Ekaterina V. Mayorova | Ilya V. Timofeev | Natalia N. Rudenko | Anatoly A. Tsygankov
俄罗斯科学院基础生物学问题研究所，PNCBI俄罗斯科学院分部，普希奇诺，莫斯科地区，142290
摘要
根据现代NiFe氢化酶的分类，《Thiocapsa bogorovii》中的HydSL氢化酶被归类为1e亚组，即所谓的isp型氢化酶。该亚组被认为包含参与硫呼吸的氢化酶；然而，直接支持这一功能的实验证据仍然有限。在本研究中，我们从中分离出一种含有HydSL氢化酶的蛋白质复合体，该复合体在H? + S? → H?S反应中表现出高活性。在天然电泳条件下，该复合体表现为单一条带，而SDS-PAGE分析将其分解为七条条带，其中四条条带的分子量与HydS、Isp1、Isp2和HydL蛋白的分子量相匹配。
将细胞置于氢气氛围中并在黑暗条件下培养，同时添加元素硫，可以增加编码该复合体亚基和伴侣蛋白的hydS、hydL、isp1和isp2基因的表达。转录水平的升高与细胞将元素硫还原为硫化氢的活性增强相关。这些观察结果表明，在无氧且缺乏可发酵底物的黑暗条件下，含有HydSL的蛋白质复合体可能参与的硫呼吸过程。基于这些结果和文献数据，我们提出了一个与该复合体功能相符的假设机制。
引言
紫色硫细菌（PSB）属于Chromatiales目，能够进行无氧光合作用。与藻类和高等植物不同，它们不使用水作为电子供体，因此不产生氧气。相反，这些细菌通常利用硫化氢或其他还原态硫化合物以及分子氢。许多PSB还能在微好氧条件下通过氧化还原态硫化合物或消耗H?进行化能自养生长。几乎所有的PSB都能在黑暗条件下进行发酵并产生氢气。此外，对于（以前称为T. roseopersicina BBS），已经证明了其HydSL氢化酶驱动的光依赖性氢气释放[1]。
T. bogorovii
的基因组至少编码五种NiFe氢化酶的结构亚基[2],[3],[4]：
- •
HupSL氢化酶，在光养或化能营养条件下吸收H?时将电子传递给泛醌池；
- •
HupUV感应氢化酶，产量极少，据信可调节的表达。需要注意的是，hupUV并不能调节的表达，因为编码相应组氨酸蛋白激酶的基因发生突变，使其产物失去功能[5]；
- •
两种Hox氢化酶，用于维持细胞内的氧化还原平衡；
- •
HydSL（也称为HynSL）氢化酶[6]。
在这些氢化酶中，只有HydSL被分离并进行了表征。该酶在暴露于O?时会发生可逆失活，但在还原性厌氧条件下可以重新激活，这一点在的氢化酶研究中也有报道[7]。此外，固定在碳电极上的HydSL即使在氧气存在下也具有电催化活性[9]。HydSL具有热稳定性[7]，能够直接将电子传递给电极[10]，并且对常见的氢化酶抑制剂CO和硫化物具有抗性[11]。这些特性使其成为燃料电池技术中替代铂催化剂的候选物质[8]。
尽管NiFe氢化酶的成熟途径复杂，涉及许多辅助蛋白[12]，但当11个辅助基因与结构基因共同表达时，中的HydSL仍能在E. coli中成功表达[13]。
在中，不同氢化酶可能激活的各种与氢相关的反应中，只有HydSL被证实能够参与利用分子氢独立于光照条件下还原元素硫的反应：H? + S? → H?S[14]。HydSL被认为仅参与这一反应[1],[15],[16]，并且也有研究提出它可能在过量的硫代硫酸盐存在下参与氢气的释放[16]。
一种新的氢化酶分类系统基于对氢化酶系统发育、保守的金属结合基序、操纵子的遗传结构以及现有公开数据的分析[17]，将
中的HydSL氢化酶归入1e亚组。该亚组还包括来自、和的氢化酶。这些氢化酶被认为参与硫呼吸过程。尽管< A. vinosum>氢化酶的结构已被解析，但目前尚无实验证据证明其在硫呼吸中的作用[18]。2007年已有研究描述了利用H?还原硫的能力[14]，但目前尚无实验证据表明HydSL与中的H?介导的硫还原过程之间存在关联。从< A. aeolicus>中纯化了两种氢化酶[19]，其中一种在系统发育上与HydSL相关；然而，最初并未报道这些酶具有硫还原活性。后续研究表明，< A. aeolicus>的膜相关氢化酶HYDII确实参与硫呼吸，且仅需四种蛋白质即可发挥作用[20]。因此，目前只有1e亚组中的一个生物体有硫呼吸的实验证据。在本研究中，我们提供了证据表明中的HydS–Isp1–Isp2–HydL复合体在H? + S? → H?S反应中起主要作用，并可能由于这些蛋白质的跨膜定位而有助于产生质子动力。我们分离出的复合体包含不超过七种蛋白质，其中四种的分子量与HydS、Isp1、Isp2和HydL亚基的预测分子量相符。该复合体在H?S生成反应中具有高特异性活性。在黑暗条件下、厌氧环境中且存在H?和S?的情况下培养细胞时，hydS、isp1、isp2和hydL的表达显著增加，而对照组（在无外加氢气的光自养条件下培养）则没有这种增加。细胞在黑暗条件下、存在H?和硫的情况下培养24小时后，硫还原活性增加了五倍以上，这支持了该复合体参与硫呼吸的过程。
生长和培养条件
Thiocapsa bogorovii细菌来自莫斯科国立大学微生物学系的菌种库。该细菌在含有0.2% NaHCO?、0.1% Na?S·9H?O、0.2% 硫代硫酸钠、20 μg/mL 维生素B??和2% NaCl的改良Pfennig培养基中，于28°C下培养[21]。细胞在光照强度为60 W/m2的条件下进行光自养生长，培养容器为470毫升，配有塞子，便于重复取样和添加补充物[22]。
HydSL氢化酶复合体（hydS–isp1–isp2–hydL）的分离
在之前的研究中，我们使用离子强度较高的HEPES缓冲液（10 g/L NaCl）获得了部分纯化的HydSL氢化酶复合体[25]。光谱分析显示，该制剂含有大量杂质。在还原元素硫为硫化氢（H? + S? → H?S）过程中表现出活性的组分不仅在280 nm处具有特征性的蛋白质吸收峰，还在380 nm（Soret带）以及590 nm、805 nm处具有额外的吸收峰。
讨论
先前的研究表明，使用高离子强度缓冲液系统有助于稳定HydSL氢化酶复合体，并首次实现了中硫还原为硫化氢的体外验证[25]。本研究中描述的改进纯化步骤使得获得了电泳上均匀的复合体，该复合体在存在元素硫和H?的条件下表现出高硫还原活性。
CRediT作者贡献声明
Makhmadyusuf Khasimov：撰写 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、数据可视化、方法验证、形式分析、数据管理、概念构建。
Ekaterina P. Petushkova：撰写 – 审稿与编辑、项目监督、方法管理、数据管理、概念构建。
Ekaterina V. Mayorova：形式分析。
Ilya V. Timofeev：数据可视化、数据管理、概念构建。
Natalia N. Rudenko：项目监督、资源调配、数据管理、概念构建。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
