《Bioconjugate Chemistry》：From Cloudy to Clear: A Strategy to Resolve the Complex Structural Elucidation of Bicycle Drug Conjugate Zelenectide Pevedotin by NMR
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本研究针对双环药物偶联物泽来奈替肽-佩维多汀结构复杂、难以表征的挑战，提出了一种基于核磁共振(NMR)的递进式策略。通过分析多个结构片段并进行比较，成功解析了其一级和高级结构，证实了模块化连接对结构影响小而对动力学影响大的特点。这项工作为未来复杂生物共轭物的结构确证提供了有效范例，对相关药物的研发和监管申报具有重要意义。
在创新药物的研发赛道上，精准地“看清”一个分子的真实样貌是确保其安全有效的前提。然而，对于一类新兴的“双环药物偶联物”(Bicycle drug conjugate?, BDC?)而言，这项任务却变得异常棘手。这类分子像是用乐高积木精心搭建的战车：一个刚性的双环肽“导航头”负责识别肿瘤靶点，通过一个可切割的连接链（linker）拖拽着细胞毒素“弹头”。这种精巧设计旨在精准杀伤肿瘤细胞，但模块化组合带来的高度复杂性也给传统的结构确证方法带来了巨大挑战。作为这类分子的一个代表，靶向Nectin-4（一种在多种实体瘤中高表达的细胞粘附蛋白）的泽来奈替肽-佩维多汀（Zelenectide pevedotin）就面临着这样的困境。它的分子量高达4103道尔顿，结构包含双环肽、连接链和微管抑制剂单甲基奥瑞斯他汀-E（MMAE）毒素。在向监管机构提交申请时，必须提供确凿证据证明分子内部的连接方式（即一级结构）符合预期。但问题在于，常用的“分子剪刀”——液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）——在面对刚性的双环结构时失灵了，双环部分难以被有效切割和碎片化。而冷冻电镜（Cryo-EM）和晶体学等方法又因MMAE的毒性在样品处理上存在限制。那么，如何才能拨开迷雾，清晰无误地确认这个复杂分子的每一个连接点呢？
为了回答这个问题，由Klara Jonasson、Andrew Feilden、Will Nesbit和Sven Wernersson组成的研究团队开展了一项研究，并巧妙地将目光投向了另一项强大的结构解析工具——核磁共振（NMR）波谱学。他们认识到，尽管对完整的泽来奈替肽-佩维多汀（化合物1）进行直接的NMR分析会因为其各部分动力学性质（刚性双环vs.柔性尾巴）的巨大差异而导致谱图复杂、信号模糊，但或许可以采取“化整为零、逐个击破”的策略。他们的核心思路是：不去硬啃完整分子这块“硬骨头”，而是分别合成并分析构成它的几个关键“积木块”，包括带有连接链的双环中间体（化合物2）、不带连接链的双环（化合物3）、线性肽类似物（化合物4）以及MMAE-连接链尾部（化合物5）。通过对比这些简化片段与完整分子的NMR数据，特别是化学位移的异同，来间接却强有力地推断和证实完整分子的结构。这项研究最终成功地运用这一递进式、比较性的NMR分析策略，完成了对泽来奈替肽-佩维多汀结构的解析，不仅证实了其预设的一级结构，还深入揭示了连接不同模块对分子整体构象和动力学行为的独特影响。相关成果已发表在学术期刊《Bioconjugate Chemistry》上。
为开展研究，作者主要运用了以下几项关键技术方法：首先，通过固相肽合成与化学环化方法合成了目标分子及其系列结构类似物（化合物1-5）。其次，使用高分辨质谱（HR-MS）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对分子量进行确认并对线性肽进行序列测定。研究的核心是系统的核磁共振（NMR）波谱分析，在11.7T和18.8T谱仪上，于DMSO-d6或水溶液中，对各个化合物采集了一系列二维NMR谱图，包括1H–1H COSY、TOCSY、NOESY，以及1H–13C HSQC等，用于化学位移归属和结构连接性验证。最后，通过化学位移指数（CSI）分析和机器学习工具ADOPT对线性肽的二级结构倾向进行了评估。
结果与讨论
MS和NMR分析泽来奈替肽-佩维多汀
对完整分子（化合物1）的初步高分辨质谱分析显示，MMAE毒素和柔性尾部区域容易碎裂，但双环部分本身在测试条件下未能碎裂，这与其刚性结构相符。质谱数据仅能部分确认结构，对于连接性的关键细节（如TATA桥连单元）则无能为力。随后的NMR分析面临更大挑战：在1H–15N HSQC谱中几乎检测不到信号；在1H–13C HSQC谱中，双环的α-碳信号弱、宽或重叠，而连接链/尾部的信号却尖锐而强烈；在NOESY谱中也观察到类似情况。这种鲜明对比源于双环支架的受限三级结构与连接链/尾部区域的高度柔性之间的差异。显然，在这种不利的谱图条件下直接进行结构解析是不可行的，这促使研究转向分别表征各个结构元件的策略。
线性肽类似物
线性肽（化合物4）通过LC-MS/MS和NMR均得到了完整的表征。NMR数据获得了近乎完整的原子特异性化学位移归属，并通过NOE相关信号验证了肽序列。化学位移指数（CSI）分析和ADOPT预测均表明，该线性肽具有高度柔性，没有明确定义的二级结构。通过比较线性肽（4）和带连接链的双环（2）在D2O中的HSQC谱图发现，两者化学位移非常相似，但双环化合物的信号线宽显著增加。这表明环化后，分子保留了与线性肽类似的无规则卷曲折叠，但灵活性因TATA桥连单元的引入而降低，符合双环结构受限的预期。对芳香族和甲基侧链共振信号的化学位移差分析进一步支持了这一结论，表明两者折叠结构相似。
双环与连接链
通过在DMSO-d6中优化条件，研究人员对双环化合物（2和3）进行了更深入的NMR分析。对于化合物2，通过TOCSY、HSQC和NOESY谱图的组合，实现了近乎完整的1H/13C化学位移归属，但TATA单元周围的信号（尤其是三个半胱氨酸的13Cβ信号）严重增宽甚至无法检测。NOE肽序列分析基本确认了肽序列，并通过一个清晰的NOE相关（Cys1酰胺质子与肌氨酸亚甲基信号之间）证实了连接链的连接性。化合物3获得了更完整的化学位移归属，其半胱氨酸13Cβ化学位移（32.6–33.4 ppm）与线性肽中游离半胱氨酸（还原态，27.7–27.8 ppm）的差异，间接支持了其与TATA形成键连的氧化态。尽管由于严重的峰增宽，泽来奈替肽-佩维多汀（1）本身无法直接完成所有原子归属，但通过与其他化合物HSQC谱图的并排比较，显示出极好的一致性，强烈支持它们具有相同的共价结构。进一步的化学位移比对（图5）显示，除了最靠近尾部区域的1Nal和Trp14残基有较大差异外，其余差异很可能在实验误差范围内。这表明不同化合物不仅共享共价结构，而且在高级结构上也高度相似，尾部取代基（R）对双环结构影响甚微。谱图质量的差异主要归因于动态行为的不同。
MMAE尾部区域
MMAE尾部在溶液中表现出高度的灵活性，其信号尖锐且很大程度上出现重复（可能源于三个三级酰胺的顺/反异构）。通过NOE相关（连接戊二酸的αCH2与β-丙氨酸酰胺质子，以及连接链缬氨酸酰胺质子）证实了尾部与双环的连接。将游离的MMAE尾部（化合物5）的化学位移与完整分子中的尾部化学位移进行比较，最大的差异出现在与双环连接的戊二酰基段，而尾部其余部分的化学位移差异很小。这证实了尾部在溶液中是灵活的，并且与双环的相互作用有限。
结论
泽来奈替肽-佩维多汀的一级结构确定是一项具有挑战性的任务，其双环核心在MS/MS中不碎裂，而显著的峰增宽和谱图重叠限制了独立NMR数据的可解读性。通过组合分析一系列类似物的互补数据，成功填补了细节并强有力地支持了其完整的一级结构。线性肽（4）与双环化合物（2）具有非常不同的灵活性，但化学位移（进而局部结构）却惊人地相似。双环化合物1、2、3之间化学位移高度相似，但灵活性有所不同。对于双环化合物，TATA单元等某些结构元件的信号无法通过与其结构其余部分的相关性直接归属，但其预期的连接性得到了多条间接证据的支持，包括半胱氨酸残基的特异性增宽、确认的半胱氨酸侧链氧化态以及与先前报道匹配的化学位移和信号增宽模式。此外，MMAE尾部区域无论是否与连接链共价结合，都表现出高度的灵活性，这证实了在双环和MMAE毒素之间设置连接链区域的预期功能。本研究观察到的一种模式——连接两个结构元件会改变其动力学而非单个元件的结构——可能也适用于其他生物共轭物。这种利用递进式数据集来解析和证明复杂结构的方法，对于未来在监管申报中阐明类似复杂分子的结构具有普遍价值。
