无需PCR的单线态氧介导的光电化学检测方法用于大肠杆菌gadA基因的检测

《Bioelectrochemistry》：PCR-free singlet oxygen-mediated photoelectrochemical detection of the Escherichia coli gadA gene

单线态氧介导的光电化学传感器实现大肠杆菌gadA基因的PCR-free检测，通过MB标记探针和磁珠杂交增强信号，灵敏度达291 pM，适用于临床及环境样本快速筛查。

Sofia Araújo Pereira | Ana Costa-Ribeiro | Prabir Kumar Kulabhusan | Adrián Sánchez-Visedo | Rui Campos

国际伊比利亚纳米技术实验室（INL），Mestre José Veiga大道无门牌号，4715-330，布拉加，葡萄牙

摘要

直接且灵敏地检测细菌病原体对于临床诊断、食品安全和环境监测至关重要。本文介绍了一种基于单线态氧（¹O?）的光电化学（PEC）检测方法，该方法无需聚合酶链反应（PCR）即可检测大肠杆菌的gadA基因，该基因是一种保守的、物种特异性的标记物，从而将这类PEC平台扩展到了细菌基因组DNA的检测领域。该检测方法采用夹心杂交格式，使用链霉亲和素包被的磁珠和甲基蓝（MB）标记的DNA探针，其中MB在光照激发下生成¹O?。¹O?驱动酚类介质的氧化还原循环，产生可测量的光电化学信号。

为了在不进行目标扩增的情况下提高检测灵敏度，研究人员开发了一种含有三个共价连接MB分子的检测探针（3?MB），并将其与单标记探针（1?MB）和杂交链反应（HCR）策略进行了对比。3?MB探针的信号强度比1?MB探针高1.8倍以上，且性能与HCR相当，同时操作流程更为简单。使用24个核苷酸的合成目标进行校准后，结果显示该方法的线性响应范围为375?pM至24?nM，检测限（LoD）为291 pM。该平台使用大肠杆菌 O157:H7的基因组DNA进行了验证，证明了其在无需PCR的情况下检测细菌基因的潜力，同时也展示了其在便携式生物传感应用中的潜力。

引言

准确、可靠且及时地识别细菌病原体是临床诊断、环境监测和食品安全保障的基石。在各种细菌威胁中，大肠杆菌（尤其是O157:H7血清型）因其与严重胃肠道疾病、溶血性尿毒综合征和食源性疾病暴发的关联而显得尤为重要。这种病原体的低感染剂量、在环境中的持久性以及污染水和食品的能力，使其检测对于公共卫生干预措施至关重要[1]。 传统的微生物学方法，如培养和生化鉴定，仍被广泛使用，但存在一些显而易见的局限性。这些方法需要数天时间才能完成，耗时较长，并且需要具备专业技能的人员在设备齐全的实验室中进行操作[2]。近年来，诸如聚合酶链反应（PCR）、实时PCR和下一代测序（NGS）等分子生物学方法显著推动了该领域的发展，实现了快速、物种特异性的细菌鉴定[3]。尽管这些技术具有高度的灵敏度和特异性，但它们依赖于先进的硬件、DNA扩增协议和精细的样本管理——这些因素限制了它们在非专业设施中的应用。 正在开发更简单、更快、更具成本效益的传感平台，其中电化学和光电化学（PEC）生物传感器成为有吸引力的替代方案。这些平台具有多种优势，包括低成本仪器、便携性、快速响应和高分析灵敏度[4]。PEC传感器通过将光学激发与电信号读出分离，提供了优异的信噪比。这种解耦使得PEC生物传感非常适合在复杂基质中检测低丰度的核酸生物标志物[3]。PEC生物传感的最新进展之一是使用单线态氧（¹O₂）作为信号生成物质[5]。这种活性分子由II型光敏剂（如甲基蓝（MB）在光照下产生。在PEC系统中，¹O₂驱动催化氧化还原反应，在目标核酸存在的情况下增强光电化学信号[5]、[6]、[7]、[8]。 基于单线态氧的光电化学传感最近已成为核酸分析中替代基于酶的扩增方法的有力手段[5]、[6]、[7]、[8]、[9]。De Wael的研究团队首次提出了基于单线态氧的电传感概念[5]，其中分子光敏剂在可见光下生成单线态氧，并将分析物催化转化为电活性物质，从而无需使用脆弱的酶试剂。后来，这一概念被应用于DNA检测[6]，通过将光敏剂标记的探针固定在磁珠上来将杂交事件转化为具有低背景噪声和良好检测限的强健PEC信号。最近，这一平台被扩展到临床相关的核酸检测：一种基于单线态氧的PEC检测方法实现了血浆中前列腺癌相关microRNA的直接定量[8]，另一种相关策略被用于检测单点KRAS突变[7]和登革热病毒[10]，表明这些系统能够在复杂的生物基质中发挥作用。使用96个LED阵列的多重检测进一步证明了基于单线态氧的PEC读出与高通量核酸传感格式的兼容性[9]。 近年来，用于检测大肠杆菌 DNA的电化学和光电化学生物传感器取得了显著进展，许多策略被报道可以提高分析灵敏度和选择性。基于金纳米星或工程电极接口的纳米结构电化学基因传感器已显示出对大肠杆菌 O157:H7 DNA的灵敏检测能力，但通常依赖于复杂的表面制备和多步骤检测协议[11]。总体而言，最近的综述指出，许多基于DNA的电化学生物传感器通过广泛的界面修饰、信号放大方案或复杂的设备架构实现了低检测限，但这可能限制了其稳健性和实际应用[12]、[13]。也有报道指出，使用定制的流体平台和优化的细胞设计实现了无需扩增的电化学DNA检测，虽然系统复杂性有所增加，但灵敏度达到了皮摩尔级别[14]。同时，基于场效应晶体管架构的高灵敏度电生物传感器也被开发出来用于细菌DNA检测，但这些方法需要先进的微制造技术和严格控制的操作条件[15]。这些研究共同表明，在分析性能和检测或设备复杂性之间存在持续的权衡，促使人们开发结合无需PCR的核酸检测与简化架构和稳健信号转导机制的替代生物传感策略。 光电化学相比其他技术具有两个非常显著的优势：i) 信号与背景之间的清晰区分；ii) 不涉及酶促反应，而这通常是分子诊断中的瓶颈。这种方法已成功应用于直接从患者血浆样本中检测与癌症相关的miRNA，无需复杂的样本处理或核酸扩增[8]，并且在KRAS突变[7]和病毒[10]的检测中也展示了概念验证。该技术还展现了可扩展性和多重检测能力；例如，一个定制的96 LED阵列被用于检测前列腺癌中上调的miRNA[9]。 除了临床诊断外，便携且快速的细菌检测系统在控制和提高食品及水质方面也越来越有价值。对于能够在现场或加工设施中部署的即时检测和微型化解决方案的需求也在增加[16]。新型材料（如分子印迹聚合物）也被用来提高这些传感器对特定细菌菌株的选择性[17]。 尽管取得了这些进展，但仍需要专门为检测细菌DNA设计的简单且极其灵敏的PEC平台。在本研究中，我们选择了gadA基因作为大肠杆菌的可靠标记物。该基因编码谷氨酸脱羧酶，这种酶有助于大肠杆菌在不利条件下（如人体胃部）生存。重要的是，gadA具有高度保守性和大肠杆菌特异性，因此是物种鉴定的理想目标[18]。 基于单线态氧的光电化学和电化学检测方法之前已被用于前列腺癌患者中microRNA的检测和定量[8]，概念验证研究也证明了它们在检测癌症相关基因突变方面的适用性[7]。据我们所知，这项工作是首次将基于单线态氧的PEC生物传感器应用于细菌基因检测，并引入了多价甲基蓝标记作为有效的信号增强策略。更广泛地说，这项研究将基于单线态氧的光电化学传感视为一种通用的无PCR核酸检测方法，其分析灵敏度在信号生成阶段得到提升，而不是通过酶促目标复制来实现。 在这里，我们报道了一种针对大肠杆菌 gadA基因的光电化学生物传感平台，采用简单的夹心杂交格式和甲基蓝标记的探针以及链霉亲和素包被的磁珠。在LED光激发下，单线态氧驱动的氧化还原反应在目标序列存在的情况下产生特征性的、可量化的光电化学信号，无需酶促目标扩增。原则上，通过重新设计捕获和检测探针，该检测方法可以适应其他DNA或RNA目标。这种无需PCR且具有靶向性的检测策略提供了简单的分析流程，并有望在未来整合到大肠杆菌筛查的生物传感工具中，应用于临床、食品安全和环境监测领域。

试剂和材料

Trizma?盐酸盐（Tris HCl）、Titriplex? III（乙二亚胺四乙酸二钠盐二水合物，EDTA）、氯化钠、磷酸盐缓冲盐水（PBS）片剂、氢醌（HQ）、4-氨基酚（4-AP）、4-硝基酚（4-NP）和Tween 20均购自Merk（葡萄牙）。使用了两种缓冲溶液：杂交缓冲液，含有5?mM Tris、0.5?mM EDTA和1?M NaCl，pH值为7.5，并加入0.05%的Tween 20（TE-T₂₀）；以及pH值为7.4的PBS溶液作为测量缓冲液。

光电化学DNA传感策略的设计与优化

在无需酶促目标扩增的情况下检测极低浓度核酸的关键策略是在转导阶段采用信号增强方法。在基于夹心的PEC检测方法中，检测探针通常只标记一个标签[5]、[6]、[8]、[9]、[22]。其他技术（如电化学发光）则利用多标记检测元件来增强信号输出[23]。在本研究中，我们评估了多标记方法的效果。

结论

本研究开发了一种无需PCR的灵敏光电化学夹心检测方法，用于检测大肠杆菌的gadA基因。该方法结合了夹心杂交和¹O₂介导的PEC转导，实现了选择性和可重复的核酸检测，而无需酶促目标扩增。 使用链霉亲和素包被的磁珠和甲基蓝标记的检测探针提供了高效的目标识别和信号生成。

CRediT作者贡献声明

Sofia Araújo Pereira：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、方法学、实验设计、数据分析。 Ana Costa-Ribeiro：初稿撰写、验证、实验设计。 Prabir Kumar Kulabhusan：撰写 – 审稿与编辑、方法学、实验设计。 Adrián Sánchez-Visedo：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、指导、实验设计、概念构思。 Rui Campos：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写。

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备这项工作时，作者使用了ChatGPT来提高文本的可读性。使用该工具/服务后，作者根据需要对内容进行了审阅和编辑，并对发表文章的内容负全责。

资助

本项工作得到了“Agenda SMARTgNOSTICS—全球抗菌素耐药性检测与诊断解决方案”项目的财政支持，项目编号为C644915155-00000024。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。