白蛋白辅助的自组装全API纳米颗粒，用于影像引导的光动力增强肿瘤免疫疗法

《Biomaterials Advances》：Albumin-hitchhiking self-assembly full-API nanoparticles for imaging-guided photodynamic potentiating tumor immunotherapy

肿瘤免疫治疗中，FeV FANPs纳米颗粒通过Fe3?与VER自组装制备，无需载体，具有优异稳定性和生物相容性。静脉给药后，通过白蛋白介导的靶向机制在肿瘤组织高效蓄积，GSH响应性释放Fe3?和VER，引发铁死亡和光动力疗法协同作用，破坏细胞内氧化还原平衡，释放DAMPs激活树突状细胞，促进抗原呈递和T细胞应答，显著抑制原发及转移性肿瘤生长。

　　

高文豪|康炳坤|徐世婷|郑大|林双|刘志宏|张倩|宋洪涛

中国人民解放军联合后勤保障部队第900医院药学系，中国福州，350025

摘要

破坏细胞内的氧化还原平衡可能调节与肿瘤损伤相关的分子模式的释放，从而促进免疫原性细胞死亡（ICD），为免疫治疗提供帮助。然而，肿瘤通常具有免疫抑制性微环境，这会阻碍ICD的激活，从而使肿瘤能够逃避免疫系统的攻击。在这项研究中，我们无需任何辅料或载体，仅通过将维替泊芬（VER）和铁离子（Fe^III）组装在一起，制备出了完全由活性药物成分（API）组成的纳米颗粒（FeV FANPs），这些纳米颗粒具有良好的稳定性和生物相容性。静脉注射的FeV FANPs能够迅速与内源性白蛋白结合，通过白蛋白辅助的靶向机制在血液中长时间循环，并有效积聚在肿瘤组织中。随后，FeV FANPs会释放VER和Fe^III，导致Fe^III引发GSH耗竭，并通过VER介导的光动力疗法（PDT）作用，共同诱导肿瘤细胞内的氧化还原失衡和铁死亡（ferroptosis），从而促进ICD。FeV FANPs通过PDT增强的免疫疗法显著抑制了原发性和转移性肿瘤的生长，为临床可应用的肿瘤免疫治疗纳米颗粒的发展做出了贡献。

引言

免疫原性细胞死亡（ICD）是一种由氧化应激激活的细胞死亡机制，它可以将原本非免疫原性的肿瘤转化为免疫反应性细胞[1]，[2]。在ICD过程中，以损伤相关分子模式（DAMPs）为特征的生物分子信号（如钙网蛋白（CRT）、三磷酸腺苷（ATP）和高迁移率蛋白1（HMGB1））通过不同的途径与树突状细胞（DCs）相互作用，促进DCs的成熟并启动抗原特异性T细胞反应[3]。鉴于ATP的释放和CRT的暴露与线粒体和内质网（ER）结构的完整性密切相关[4]，[5]，破坏线粒体或ER的完整性可能为同时抑制肿瘤和有效诱导ICD提供一种有前景的方法。

铁死亡（ferroptosis）是一种特殊的程序性细胞死亡方式，其特点是依赖于铁并引发脂质过氧化（LPO）[6]，[7]，最终导致DAMPs的释放，从而增强ICD效果。越来越多的证据表明，多种疗法可以提高细胞内活性氧（ROS）的水平，从而触发LPO[8]，[9]，[10]。光动力疗法（PDT）通过激活光敏剂来氧化不饱和脂质，促进细胞内LPO的发生，在癌症治疗中受到了广泛关注，因为它具有侵入性小、副作用少且不易产生耐药性的优点[11]，[12]。PDT产生的ROS可以诱导肿瘤细胞内的氧化应激，从而破坏蛋白质、DNA和细胞器膜的完整性[13]，[14]，[15]。此外，PDT产生的ROS还可以减轻M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的免疫抑制作用[16]，促进巨噬细胞的表型转变，并有助于缓解肿瘤的免疫抑制微环境。利用光敏剂来介导线粒体或ER的ROS依赖性破坏是一种有效的ICD诱导策略。

肿瘤内高水平的谷胱甘肽（GSH）[17]，[18]有助于维持细胞内的氧化还原平衡，从而减弱ICD的效果。因此，设计破坏氧化还原平衡的策略对于提高免疫治疗的效果至关重要。通过增加细胞内铁离子浓度来增强芬顿反应（Fenton reaction）并增加羟基自由基（OH）的产生，可以提高肿瘤治疗中铁死亡的效果。为了在癌症治疗中取得高效且显著的结果，已经开发了多种铁离子催化剂。然而，将这些催化剂结合到不同的纳米载体中往往会导致诸如辅料相关的毒性、药物装载效率低和药物过早泄漏等问题[19]，[20]。在铁离子发生价态转变过程中，GSH会被消耗，导致谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）失活，ROS清除能力下降，LPO加速，进而引发铁死亡。破坏ROS与抗氧化剂（如GSH）之间的平衡可以增强PDT的效果，有望有效触发肿瘤ICD，从而提高肿瘤免疫治疗的疗效。因此，开发具有协同作用的基于铁的纳米载体，既能消耗GSH又能生成ROS，是非常重要的。这种方法旨在通过整合铁死亡和PDT来破坏肿瘤的免疫抑制微环境。

纳米药物递送系统已被广泛用于改善药物的理化性质和优化肿瘤靶向性，在生物医学领域展现出巨大潜力[21]，[22]。然而，传统的载体辅助药物递送系统面临制备过程复杂、药物装载能力有限以及体内安全性问题等挑战，这些限制了它们的临床应用[23]，[24]，[25]。相比之下，完全由活性药物成分（API）组成、不添加外源性惰性载体的无载体纳米药物[26]，[27]，[28]，[29]代表了纳米医学领域的一项重要进展，能够解决这些限制。然而，开发具有最佳活性成分装载量和良好体内稳定性的智能纳米药物仍然是一个紧迫且具有挑战性的任务。

在这项研究中，我们合理设计并制备了完全由Fe^III和VER组成的API纳米颗粒（FeV FANPs）（图1）。通过尾静脉注射给药后，循环中的白蛋白捕获了FeV FANPs，调节了它们的光反应性并抑制了ACQ效应。与白蛋白结合的纳米颗粒可以与肿瘤血管内皮细胞上的糖蛋白60受体结合，并与肿瘤微环境中分泌的富含半胱氨酸的酸性蛋白质相互作用[30]，[31]，[32]。这种双重相互作用增强了肿瘤细胞对白蛋白结合纳米颗粒的摄取。随后，在肿瘤组织中过表达的GSH的作用下，VER和Fe^III被释放出来。Fe^III氧化GSH使其还原为Fe^II，进而参与芬顿反应生成高毒性的羟基自由基。这一过程促进了肿瘤细胞内脂质过氧化物的积累，诱导了铁死亡。同时，在激光照射下释放的VER进一步消耗了肿瘤细胞内的GSH水平，增强了铁死亡的抗肿瘤效果，并诱导了ICD，激活了一系列免疫反应，包括抗原释放、抗原呈递和T细胞激活。最终，FeV FANPs介导的PDT和免疫治疗显著抑制了原发性和转移性肿瘤的生长。这种简单而强大的纳米颗粒设计有望推动纳米医学在临床应用中的发展。

材料

维替泊芬（VER）购自Heowns Biochem Technologies, LLC（天津，中国）。六水合三氯化铁（Fe^III）由Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.（上海，中国）提供。人血清白蛋白（HSA）来自Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.（上海，中国）。亚甲蓝（MB）由Aladdin（上海，中国）提供。O-苯二胺（OPD）购自Macklin（上海，中国）。抗CRT-Alexa Fluor 488和抗HMGB1-FITC抗体由...

FeV FANPs的特性分析

这些完全由API组成的纳米颗粒是通过我们团队之前开发的单步自组装技术合成的[33]，利用了Fe^III和FDA批准的光敏剂VER之间的相互作用。VER的含量通过UV–Vis光谱测量（图S1）。图2A中的扫描电子显微镜（SEM）图像显示FeV FANPs具有球形纳米形态，证实了这些纳米颗粒的成功合成[34]，

结论

总结来说，我们成功开发了一种完全由API组成的纳米药物FeV FANPs，它完全由VER和Fe^III自组装而成，表现出优异的稳定性和生物相容性。在生理条件下，FeV FANPs能够与白蛋白结合，作为一种将靶向肿瘤荧光成像与光控免疫治疗相结合的试剂。芬顿反应介导的GSH耗竭增强了VER的PDT效果，启动了一系列免疫反应，

CRediT作者贡献声明

高文豪：撰写初稿、软件开发、实验设计、数据分析、概念构建。康炳坤：验证结果、软件开发、实验设计、数据管理。徐世婷：结果验证、软件开发、资源协调、数据管理。郑大：实验设计、数据分析。林双：软件开发、实验设计。刘志宏：研究指导、实验设计。张倩：研究指导、资金获取、概念构建。宋洪涛：撰写修订稿、研究指导、概念构建。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了福建省自然科学基金的支持（资助编号：2024J01511）。作者感谢Phadcalc（www.phadcalc.com）提供的分子对接模拟服务。