《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Modulation of the gastrointestinal immune environment by chitosan microparticles loaded with
Mycobacterium bovis BCG in a
Cavia porcellus model
in vivo, leading to reduced experimental
H. pylori gastric colonization
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为应对幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）日益严峻的抗生素耐药性问题，研究人员设计了一种新型递送系统，探索非抗生素疗法。他们采用喷雾干燥技术制备了分别修饰有N-乙酰-D-葡萄糖胺（Glc-NAc）和泊洛沙姆F127（Pluronic F127）的壳聚糖微颗粒，用于包裹具有免疫调节特性的牛分枝杆菌BCG（Mycobacterium bovis BCG），并在Cavia porcellus（豚鼠）模型中进行体内评估。结果表明，预先口服这两种微颗粒能有效将BCG递送至胃或肠道，并通过诱导调节性/耐受性免疫反应、减少胃黏蛋白MUC5AC，从而显著降低后续Hp的定植水平。这为基于免疫调节和抗菌特性的新型抗Hp制剂开发提供了候选方案。
在全球范围内，超过一半的人口胃黏膜中定植着一种名为幽门螺杆菌（Helicobacter pylori， Hp）的革兰阴性杆菌。这种感染与胃炎、胃或十二指肠溃疡、胃癌等疾病的发展密切相关，甚至可能与冠心病等全身性疾病有关。更棘手的是，Hp能够巧妙地逃逸宿主的免疫机制，而其对抗生素的耐药性日益增加，使得以抗生素和质子泵抑制剂为主的常规疗法效果逐渐下降，根除率已低于可接受水平。此外，广谱抗生素还常常破坏肠道菌群，导致菌群失调。因此，世界卫生组织已将Hp列为12种最关键的抗生素耐药菌种之一，寻找新的替代疗法迫在眉睫。
在这一背景下，由波兰罗兹大学的Weronika Gonciarz等人领导的研究团队，将目光投向了非抗生素策略。他们设想，能否利用具有强大免疫调节能力的减毒活疫苗——牛分枝杆菌卡介苗（Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin， BCG）来“训练”宿主的免疫系统，从而对抗Hp感染呢？然而，直接口服BCG会面临胃酸破坏和有效递送的挑战。为此，研究人员设计了一种精巧的“运输工具”——壳聚糖微颗粒（Chitosan Microparticles， MPs）。壳聚糖本身具有黏膜粘附和抗菌特性。他们进一步对微颗粒进行了“武装”：一种用N-乙酰-D-葡萄糖胺（Glc-NAc）修饰，旨在在胃的酸性环境中释放BCG；另一种用泊洛沙姆F127（Pluronic F127）修饰，旨在保护BCG通过胃部，使其在肠道（黏膜免疫系统的中心）释放。这项研究成果发表在《Biomedicine 》上，旨在探究这些搭载BCG的微颗粒能否在豚鼠模型中调节胃肠道免疫环境，从而降低Hp的实验性胃定植。
为了开展这项研究，作者们运用了几个关键的技术方法。首先是利用喷雾干燥法制备了负载活BCG的两种修饰壳聚糖微颗粒（G MPs和P MPs），并进行了表征。研究选用豚鼠（Cavia porcellus）作为H. pylori感染的实验模型，因其胃部结构与人类相似，是研究胃部感染和免疫反应的合适动物。研究设计了多个实验组，通过口服方式给予豚鼠不同处理（单独Hp、单独MPs、MPs预处理后感染Hp等），并在感染后第7天和第28天采集样本。关键的分析技术包括：使用定量聚合酶链反应（qPCR）检测胃组织中Hp的cagA和ureC基因拷贝数以评估细菌定植水平；通过免疫荧光染色和酶联免疫吸附试验（ELISA）定量胃黏蛋白MUC5AC和病原体；利用组织化学（H&E和Chromotrope 2R染色）和多重免疫荧光染色对胃组织进行详细的免疫细胞表型分析（如CD45+、CD4+、CD8+、Foxp3+T细胞等）；并通过ELISA和比色法检测胃组织和血清中的细胞因子（如TNF-α、IL-10等）以及氧化应激和再生标志物（如MPO、4HNE、survivin等）。
研究结果部分如下：
3.1. 基于qPCR和SEM的胃组织Hp定植水平，及其与MUC5AC沉积的关系
研究通过扫描电镜（SEM）直观展示了Hp在胃组织中的定位。定量PCR（qPCR）结果显示，与仅感染Hp的动物相比，预先口服G/P MPs BCG（即两种微颗粒联合使用）的动物，在感染后第28天，其胃组织中Hp毒力基因cagA的拷贝数显著降低至接近基线水平。免疫荧光分析表明，Hp感染会显著增加胃黏蛋白MUC5AC（Hp附着的关键受体）的沉积，而预先给予MPs BCG处理则能减少MUC5AC的水平，这与Hp定植的减少相关。生物传感器分析进一步证实了BCG能够与MUC5AC结合，提示了其可能通过竞争性结合来干扰Hp的附着。
3.2. 研究豚鼠胃局部白细胞浸润的分级和特征
组织病理学分析显示，仅感染Hp的动物胃黏膜出现以中性粒细胞为主的混合性白细胞浸润。相比之下，预先用MPs BCG处理再感染Hp的动物，其浸润更为显著（3级），且富含淋巴细胞和大量嗜酸性粒细胞。免疫表型分析揭示，MPs BCG处理（无论是否后续感染Hp）能显著增加胃组织中CD45+白细胞总数，其中以幼稚（CD45RA+）表型为主。而仅感染Hp的动物则以激活/记忆（CD45RO+）表型的白细胞为主。进一步分析T淋巴细胞亚群发现，MPs BCG预处理并感染Hp的动物，其胃组织中CD3+、CD4+和CD8+T细胞数量均显著增加。相关性分析表明，在该组动物中，胃黏膜CD8+T淋巴细胞浸润的增加与Hp特异性DNA的减少显著相关。此外，MPs处理还诱导了组织驻留记忆T细胞（CD69+/CD103+）和调节性T细胞（Foxp3+）数量的上升。
3.3. MPs负载的M. bovis BCG对局部细胞因子反应的调节
细胞因子谱分析揭示了不同的免疫环境。仅感染Hp的动物，其胃组织中促炎细胞因子（如TNF-α、IL-1α、IL-2、IL-8、IL-12(p40)、IL-17、IL-33和嗜酸细胞活化趋化因子）水平显著升高。而预先用MPs BCG处理再感染Hp的动物，在感染早期（第7天）仅IL-2、IL-33和嗜酸细胞活化趋化因子升高，其他促炎因子水平与对照组相当。至第28天，TNF-α、IL-1α、IL-2、IL-33和嗜酸细胞活化趋化因子水平仍较高，但IL-8、IL-2、IL-13和嗜酸细胞活化趋化因子水平低于仅感染Hp的组。热图分析显示，Hp感染组以促炎因子TNF-α和IL-12(p40)为主导，而MPs预处理组则显示出抗炎因子IL-10水平随时间的升高，表明免疫环境向调节/耐受方向转变。
3.4. MPs在豚鼠胃组织中的抗炎和促再生作用
MPs BCG的预处理显著减轻了Hp感染引起的组织损伤。与仅感染Hp的动物相比，预处理动物的胃组织中，标志炎症和氧化应激的髓过氧化物酶（MPO）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和4-羟基壬烯醛（4HNE）水平均显著降低。血清中的C反应蛋白（CRP）水平也相应下降。此外，预处理还降低了促凋亡标志物裂解的半胱天冬酶-3（CC3）的水平，并提高了与组织再生相关的Mcl-1/Bak二聚体和生存素（survivin）的水平，表明其具有抑制细胞凋亡和促进组织修复的潜力。
结论与讨论部分归纳如下：
本研究成功开发了两种pH响应型的壳聚糖微颗粒（G MPs和P MPs），能够有效地在胃或肠道中递送活的BCG。在豚鼠模型中，口服这些负载BCG的微颗粒，特别是在联合使用（G/P MPs）的情况下，能够显著降低后续Hp感染的定植水平，这种效应在感染后期（28天）尤为明显。
其作用机制是多方面的：首先，BCG可能通过竞争性结合胃黏蛋白MUC5AC，物理性干扰了Hp的附着。其次，也是更重要的，MPs BCG的预处理深刻重塑了胃部的免疫微环境。它诱导了以大量嗜酸性粒细胞、CD8+T细胞、组织驻留记忆T细胞和调节性T细胞（Foxp3+）为特征的复杂免疫细胞浸润。虽然总体白细胞数量增加，但细胞因子谱显示促炎反应（如TNF-α, IL-8）受到抑制，而抗炎/调节性因子（如IL-10）的作用增强，提示免疫反应从单纯的促炎攻击转向了更具调节性和可能耐受性的状态。这种免疫环境的转变，连同CD8+T细胞浸润与细菌清除的正相关，可能共同促进了Hp的控制。最后，MPs BCG预处理还通过降低氧化应激标志物（MPO， 4HNE）、减少细胞凋亡（CC3）和上调再生标志物（Mcl-1/Bak， survivin），发挥了保护胃黏膜屏障和促进组织修复的作用。
综上所述，这项研究提供了一种基于免疫调节和黏膜递送的新型抗Hp策略。将具有固有免疫训练能力的BCG通过智能型壳聚糖微颗粒靶向递送至胃肠道，不仅能直接或间接抑制Hp定植，还能调节局部免疫反应向有利于控制感染且减少组织损伤的方向发展。这为克服Hp抗生素耐药性、开发基于免疫干预的非抗生素疗法提供了有前景的实验依据和候选制剂。未来的研究将集中于优化微颗粒配方、阐明详细的分子免疫机制，并评估其在临床转化中的潜力。
