新金黄色分枝杆菌（Mycobacterium neoaurum）中3-酮类固醇Δ1-脱氢酶（KstD4和KstD5）的特性及其对植物甾醇转化的影响

《Bioorganic Chemistry》：Characterization of 3-ketosteroid Δ1-dehydrogenases (KstD4&5) of Mycobacterium neoaurum and their effects on phytosterol transformation

植物甾醇（PS）向HBC转化中，M. neoaurum WIII基因组通过生物信息学分析鉴定出新型KstD4/KstD5，证实两者分别偏好HBC和AD的C1位脱氢，基因敲除后HBC产量提升至34.20 g/L，副产物1,4-HBC降至0.12 g/L。

　　

Lvqing Xu|Xiao Wang|Siyuan Ma|Jian Zhang|Xuedong Wang

华东理工大学，中国上海梅龙路130号

摘要

Mycobacterium neoaurum能够将植物甾醇（PS）转化为类固醇中间体，如HBC（22-羟基-23,24-双诺科尔-4-烯-3-酮）。然而，3-酮类固醇Δ¹-脱氢酶（KstD）可以催化类固醇核的C1位置的脱氢反应，从而导致副产物22-羟基-23,24-双诺科尔-1,4-二烯-3-酮（1,4-HBC）的积累。这一过程还伴随着类固醇骨架的9-羟基化，最终导致B环的自发降解。利用已知的KstD1–3序列作为探针，生物信息学分析在M. neoaurum WIII中发现了两种新的3-酮类固醇Δ¹-脱氢酶（KstD4和KstD5）。表达< />和的重组E. coli BL21菌株表现出对HBC和雄烯二酮（AD）的C1位置脱氢活性。纯化酶的实验表明，KstD5更倾向于催化C-19类固醇中间体AD的脱氢反应，而KstD4则更倾向于催化不完整的侧链降解中间体HBC。这些发现表明KstD4和KstD5具有不同的生理功能，但两者都参与了类固醇核的降解和副产物的积累。在M. neoaurum中失活KstD4和KstD5后，1,4-HBC的浓度从0.27?g/L降低到0.12?g/L，HBC的产量从32.85?g/L增加到34.20?g/L。此外，突变菌株在工业相关条件下表现更好，包括在环糊精比例较低和模拟自溶细胞的条件下。

引言

类固醇药物具有广泛的临床应用，包括抑制炎症反应和病毒复制、缓解过敏和哮喘、治疗类风湿性关节炎和某些癌症，以及调节激素水平和血压[1]、[2]、[3]。传统上，类固醇药物是通过多步骤化学合成从薯蓣皂苷制备的，但其生产受到薯蓣属植物资源有限的限制[4]、[5]。近年来，微生物生物转化甾醇已成为类固醇药物中间体生产的可持续替代方法。分枝杆菌能够利用甾醇作为能源，被广泛用作将植物甾醇（PS）转化为有价值的类固醇中间体的细胞工厂[6]、[7]。

分枝杆菌中类固醇的代谢过程可以分为两部分：核的降解和侧链的降解[8]。侧链的降解是一系列类似于脂肪酸β-氧化的反应，根据侧链是否完全降解，产物可以分为两种类型：C-19中间体（如4-雄烯-3,17-二酮（AD）或C-22中间体（如22-羟基-23,24-双诺科尔-4-烯-3-酮（HBC）[9]。HBC是一种侧链未完全降解的产物，是合成孕激素和肾上腺皮质激素的核心前体。核的降解是细菌将甾醇完全代谢为H₂O和CO₂的关键反应。在分枝杆菌中，KstD（3-酮类固醇Δ¹-脱氢酶）和KSH（3-酮类固醇9α-羟化酶）分别可以在C1位置引入碳-碳双键和在C9位置引入α-OH[10]、[11]。由此产生的不稳定中间体会发生B环的自发断裂和A环的芳香化[12]、[13]，形成3-HSA并进入A、D和C环的后续开环反应，最终代谢为CO₂和H₂[14]、[15]。

为了提高生物转化效率，必须严格控制KstD和KSH的活性，以减少类固醇核的降解。因此，鉴定相关基因是构建工程生产菌株的关键。在M. neoaurum ATCC 25795中鉴定出了三种KstD，在M. fortuitum ATCC 35885中鉴定出了五种KstD[16]、[19]。敲除分枝杆菌中的和或通过改变反应温度抑制其活性可以显著减少核的降解[20]。然而，分枝杆菌中存在多种KstD和KSH，这使得获得优良菌株并改善甾醇生物转化变得更加困难。

在之前的研究中，通过敲除< />和< />构建了产生HBC的M. neoaurum WIII菌株。然而，在PS转化过程中，副产物22-羟基-23,24-双诺科尔-1,4-二烯-3-酮（1,4-HBC）的积累和类固醇核的降解仍然存在[21]，降低了HBC的产量并影响了下游产物的分离。在这项工作中，通过生物信息学分析鉴定了M. neoaurum WIII基因组中可能的冗余KstD。对这些候选酶的功能进行了表征，并对菌株进行了改造以改善PS的转化效果。这种方法有助于阐明KstD的功能冗余性，并促进了利用分枝杆菌进行PS生物转化的实际应用。

章节片段

化学品、菌株和质粒

PS来自中国上洛的山西Sciphar天然产物有限公司。工业级HP-β-CD来自中国滨州的山东滨州志远生物技术有限公司。其他试剂均为分析级试剂。HBC标准品购自上海的Sigma公司。本研究中使用的菌株和质粒详见表S1。

对M. neoaurum的基因改造方法

DNA克隆和纯化按照标准程序进行。相关DNA片段被克隆到pET28a载体中

基于生物信息学分析鉴定冗余的1-脱氢酶

M. neoaurum WIII是一种通过删除< />和< />基因进行改造的菌株，能够将低价值的PS转化为高价值的类固醇中间体HBC[9]。然而，PS的生物转化仍然会导致1,4-HBC（一种在C1位置脱氢的副产物）的积累以及类固醇核的降解。这些结果表明M. neoaurum WIII中仍存在残留的1-脱氢酶活性。

使用已鉴定的基因对M. neoaurum WIII基因组进行BLAST分析

结论

利用M. neoaurum ATCC 25795中的KstD1、KstD2和KstD3作为探针，通过生物信息学分析鉴定了另外两种KstD，分别命名为KstD4和KstD5。本研究阐明了KstD4和KstD5在M. neoaurum中的功能，这两种酶都表现出对类固醇的1-脱氢活性，但底物偏好不同。在M. neoaurum中失活KstD4和KstD5后，HBC的产量从32.85?g/L提高到34.20?g/L，副产物1,4-HBC的浓度从0.27?g/L降低到0.12?g/L

CRediT作者贡献声明

Lvqing Xu：撰写——原始草稿、方法学、实验设计、数据分析。Xiao Wang：撰写——审阅与编辑、方法学、实验设计、数据分析。Siyuan Ma：撰写——审阅与编辑、验证、实验设计。Jian Zhang：撰写——审阅与编辑、数据可视化、验证、监督。Xuedong Wang：撰写——审阅与编辑、验证、监督、资源管理、项目协调、方法学设计、概念构思。

未引用的参考文献

[17], [18]

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。