《Bioorganic Chemistry》：Identification of the ZU5 domain in UNC5C as a potential receptor for Schisandrin A: experimental and computational insights
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Schisandrin A通过噬菌体展示肽库和BLAST筛选出39个潜在体内受体，并以UNC5C的ZU5域为对象，结合荧光光谱、ITC和分子动力学模拟，揭示了其自发结合机制（范德华力与氢键主导），关键残基Leu61和Leu96，以及苯基和甲氧基对受体识别的影响，为神经退行性疾病治疗和药物结构优化提供依据。
Jiaxin Zhang|Zhuanhong Wang|Jurong Zeng|Xiaoting Dong|Liujiao Bian
中国西安医科大学基础医学系脑疾病重点实验室与基础与转化医学研究所，西安710021
摘要
尽管有关于五味子素A潜在临床和药理机制的众多报道，但仍迫切需要全面筛选。在本研究中，我们使用噬菌体展示肽库结合基本局部比对搜索工具（Phage Display Peptide Library and Basic Local Alignment Search Tool）筛选了39种可能的五味子素A体内受体。进一步通过荧光光谱、等温滴定量热法和分子动力学模拟研究了五味子素A与netrin受体UNC5C异构体X1中的ZU5结构域的结合机制。结果表明，五味子素A通过焓变自发地与等摩尔的ZU5结合，主要作用力为范德华力和氢键。ZU5中环结构的明显波动以及一个无规卷曲结构转变为α-螺旋结构的现象符合诱导契合理论。ZU5中的Leu61和Leu96参与了多种类型的相互作用，并贡献了最大的能量，表明它们在五味子素A结合过程中起关键作用。此外，五味子素A中的联苯环和甲氧基可能对其受体识别及生理效应至关重要，因为它们深度参与了与ZU5的结合过程。总之，本研究不仅筛选出了39种可能的五味子素A体内受体，并验证了ZU5作为候选受体的可能性，还为实验和计算方面的详细结合机制提供了宝贵信息，有助于神经退行性疾病的治疗机制研究和五味子素A的结构修饰研究，从而可能促进其临床应用。
引言
五味子素A（图1）是传统中药Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.中最主要的生物活性成分之一，已被广泛报道具有治疗心血管疾病、肝细胞损伤、癌症、骨关节炎尤其是阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）等神经退行性疾病的巨大潜力[1],[2],[3],[4],[5]。其治疗效果主要基于其多种生物功能，包括抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤和增强DNA甲基化作用[6]。例如，五味子素A可以通过调节TNF和NF-kB信号通路来缓解氧化应激和炎症，从而改善肝细胞的急性损伤[7]；通过抑制MAPK和NF-κB信号通路来延缓软骨退化[3]；此外，五味子素A还能通过产生内皮细胞一氧化氮和血管平滑肌细胞肌球蛋白轻链的去磷酸化来发挥心血管保护作用[8]。另外，五味子素A可以通过诱导ROS介导的内质网应激、JNK MAPK信号通路激活、抑制表皮生长因子受体激活[2]、触发线粒体损伤和铁死亡[9]以及抑制热休克因子1[10]来促进肿瘤凋亡，从而具有潜在的抗癌作用。同时，五味子素A通过调节PI3K/AKT和IKK/IκBα/NF-κB通路来发挥神经保护作用[11]，通过上调SH-SY5YAB 1-40神经元细胞系中的DNMT 3A&B的转录和表达来促进DNA甲基化[12]，通过调节神经递质及其代谢物变化来减少Aβ沉积[13]，通过miR-155/NF-κB轴调节神经炎症[4]，通过参与AMPK/mTOR通路抑制神经元细胞自噬[14]，并通过诱导溶酶体酸化来维持溶酶体稳态和神经元细胞存活[5]。
如上所述，尽管已有大量关于五味子素A药理机制的报道，但由于缺乏体内受体的探索，该机制仍需进一步研究——据我们所知，目前仅报道了三种潜在受体（CYP、V-ATPase的ATP6V0d1亚基和ALOX5）[5],[15],[16]。因此，迫切需要寻找五味子素的体内受体并直接研究其结合机制，以全面了解其药理功能。为此，我们在本研究中首先利用五味子素的修饰和偶联固定技术，结合噬菌体展示肽库（Phage Display Peptide Library，PDPL）和基本局部比对搜索工具（BLAST）筛选了五味子素的体内受体。为了进一步验证筛选结果的准确性并研究五味子素A与其候选受体之间的相互作用机制，选择了netrin受体UNC5C异构体X1（登录号XP_054207122.1，以下简称UNC5C）作为研究对象。UNC5C是一种长度为950个氨基酸的单跨膜蛋白，含有6个结构域，在海马体和小脑神经元中广泛表达，与神经退行性疾病密切相关[17],[18],[19]。此外，五味子素A的高亲和力肽位于细胞内的ZU5结构域（547–650个氨基酸）（图S1），这提示ZU5结构域可能是五味子素A预防/治疗AD和PD的关键靶点。因此，我们最终通过荧光光谱、等温滴定量热法（ITC）和分子动力学模拟（MDS）研究了五味子素A与其候选受体ZU5之间的结合机制，包括热力学和构象变化方面。整个工作流程如图1所示。
试剂和材料
五味子素A、琥珀酸酐、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCL）、异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）、4-甲苯磺酸一水合物（p-TsOH一水合物）和N, N-二甲酰胺（DMF）均购自Sigma-Aldrich公司（中国上海）。牛血清白蛋白（BSA）购自Amresco Technology公司（美国宾夕法尼亚州）。8000 MWCO膜购自Yi Bo Biological公司（中国长沙）。Ph.D. -
五味子素的修饰
质谱（MS）显示粗产物修饰后的鉴定结果如图2所示，表明五味子素A以与Na+结合的离子形式存在（m/z，455.3）。在m/z值为555.2处的相对较高峰对应于五味子素的羧基化衍生物，这与理论预测一致（内框）。值得注意的是，五味子素的生物活性主要取决于其联苯结构和甲氧基
讨论
据报道，UNC5C及其配体netrin-1与阿尔茨海默病和帕金森病密切相关[68],[69]。具体来说，netrin-1的缺失会诱导细胞内caspase-3和δ-分泌酶/天冬酰胺内肽酶的激活，进而依次切割UNC5C的细胞内结构域，促进神经细胞凋亡，最终导致神经退行[17],[19]。因此，推测五味子素A与ZU5的结合
结论
总结来说，本研究通过PDPL和BLAST结合五味子素的修饰和偶联固定技术筛选了五味子素的潜在体内受体，并验证了netrin受体UNC5C异构体X1中的ZU5结构域作为候选受体。结合荧光猝灭光谱、等温滴定量热法和分子动力学模拟研究了其结合机制。质谱和傅里叶变换
CRediT作者贡献声明
Jiaxin Zhang：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化、监督、软件使用、资源管理、项目管理、方法学设计、资金申请、数据分析、概念构建。Zhuanhong Wang：撰写——初稿、可视化、方法学设计、实验研究、数据管理。Jurong Zeng：撰写——审稿与编辑、可视化、结果验证、方法学设计、数据分析。Xiaoting Dong：可视化、结果验证、方法学设计、实验研究，
资助
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：82204773）的资助。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究工作的财务利益或个人关系。
