一种新型抗菌肽Anguinin（序列为55–72），从日本鳗（Anguilla japonica）中分离得到，具有抵御Edwardsiella tarda感染的作用

《Bioorganic Chemistry》：A novel antimicrobial peptide Anguinin 55–72 identified from Anguilla japonica exhibiting protection against Edwardsiella tarda infection

抗埃德尔斯菌新型抗菌肽Anguinin55-72的发现及其作用机制研究。该研究通过转录组分析鉴定出日本鲻新基因Anguinin，其截断肽55-72对埃德尔斯菌具有广谱抗菌活性，通过破坏细菌膜结构、诱导氧化应激及抑制生物膜形成发挥作用，同时保持高温稳定性且无细胞毒性。体内实验证实该肽可显著提高斑马鱼和日本鲻的存活率，降低炎症因子IL-6、IL-8和TNF-α表达。该成果为开发新型抗细菌药物提供了理论依据。

　　

郑文斌|陈芳怡|于文豪|高婷婷|严子源|白玉琪|孙航|王克健

中国厦门大学海洋与地球科学学院海洋环境科学国家重点实验室，厦门361102

摘要

Edwardsiella tarda对鱼类种群构成严重威胁，会引起严重的系统感染，尤其是在经济价值较高的物种中更为明显，例如日本鳗鱼（Anguilla japonica）。目前的治疗选择有限，而多重耐药菌株的出现进一步凸显了开发新型抗菌替代品的紧迫性。抗菌肽因其广泛的活性范围和较低的耐药性发展潜力而成为有前景的替代品。在这项研究中，我们从A. japonica中鉴定出一个新的功能基因，命名为Anguinin，该基因编码一种由99个氨基酸组成的成熟肽。在健康A. japonica的各种组织中广泛表达Anguinin基因，并且在E. tarda感染后，在与免疫相关的组织中表现出显著诱导作用。从该基因衍生出的截短肽Anguinin_55–72对多种病原体表现出强烈的抗菌活性。机制研究表明，Anguinin_55–72能够破坏细菌膜，增加膜通透性，并触发活性氧的积累，最终导致细菌死亡。该肽还表现出抗生物膜活性，并且在高温下保持稳定性而不会产生细胞毒性。我们使用感染了E. tarda的斑马鱼和日本鳗鱼构建了体内动物模型。结果表明，Anguinin_55–72显著提高了Danio rerio和A. japonica的存活率。此外，在日本鳗鱼模型中，Anguinin_55–72显著降低了疾病严重程度，减少了细菌负荷，下调了促炎细胞因子的表达，并促进了组织损伤的恢复。总体而言，Anguinin_55–72作为控制E. tarda感染的常规抗生素替代品具有巨大潜力，有助于应对日益严重的抗生素耐药性问题。

引言

Edwardsiella tarda是一种兼性厌氧革兰氏阴性细菌，可引起鱼类疾病——爱德华氏菌病[1]。这种疾病在鱼类中表现为多种症状，包括败血症、肝肾炎、鳗鱼溃疡病和鳗鱼肝肾综合征。它已在全球多种经济重要的鱼类物种中被报道，如日本鳗鱼（Anguilla japonica[2]、[3]、罗非鱼（Oreochromis niloticus[4]、红鲷鱼（Pagrus major[5]、大比目鱼（Scophthalmus maximus[6]和沟鲶鱼（Ictalurus punctatus[7]），对水产养殖造成了重大危害。特别是败血症，导致全球淡水和海水养殖动物的高死亡率（高达70%）和显著的经济损失[8]。尽管在爱德华氏菌病的研究方面取得了进展，并开发了几种有效的疫苗候选物，但这些疫苗尚未实现商业化大规模应用。因此，预防和控制爱德华氏菌病的主要措施仍然是使用抗生素，包括头孢菌素、氨苄西林、氨基糖苷类和氟喹诺酮类[1]、[9]。

不可否认，自1928年亚历山大·弗莱明发现青霉素以来，抗生素在水产养殖和畜牧业中发挥了重要作用[10]。它们被广泛用于治疗由微生物感染引起的疾病。此外，抗生素还被广泛用于促进牲畜的生长和生产力，导致其使用量迅速增加。然而，抗生素的广泛使用和频繁滥用导致了严重的微生物耐药性问题，导致治疗效果下降、发病率和死亡率上升以及医疗成本增加[11]。在非人类动物中的抗生素使用，特别是在农业和水产养殖中，显著促进了耐药性的发展，这对人类也产生了影响[12]。根据对抗菌耐药性的全面全球分析，预计从现在到2050年，可能有超过3900万人死于抗生素耐药性病原体的感染[13]。因此，减少抗生素的使用对于遏制环境中、食物链中以及动物体内的抗生素耐药性细菌的传播至关重要，从而降低相应的公共卫生风险[14]。同时，探索和开发常规抗生素的有效替代品也至关重要。

抗菌肽（AMPs）被科学家誉为“天然抗生素”，是传统抗生素极具前景的天然替代品[15]。它们在先天免疫系统中起着关键作用，对细菌、真菌和病毒具有广泛的效力。此外，它们还有助于调节免疫反应并执行其他多种生物功能[16]。AMPs通过三种主要机制发挥抗菌作用：抑制细胞壁合成并破坏其完整性[17]；与带负电荷的微生物膜相互作用以增加通透性，导致膜破裂和细胞内容物泄漏[18]；以及破坏细胞内器官并干扰正常代谢活动，从而导致细菌死亡[19]。此外，AMPs具有快速的杀菌作用、高协同效应和低耐药性诱导倾向[20]。这些特性使得AMPs在临床医学、食品工业、畜牧业和水产养殖中的应用前景广阔[21]、[22]。

有趣的是，AMPs存在于所有生命形式中，是先天免疫系统的重要组成部分[23]。鱼类作为主要的水生动物，具有产生抗体的特定免疫系统，但抗体数量有限，淋巴细胞成熟缓慢，研究表明先天免疫系统对它们抵御病原体至关重要[24]。日本鳗鱼（Anguilla japonica）是一种溯河性肉食性鱼类，广泛分布于西太平洋的淡水栖息地。其生命周期包括六个阶段，需要从海洋迁移到河流，然后再回到海洋。这种独特的生命周期可能使其更依赖先天免疫效应器，使其成为发现新型AMPs的宝贵资源。迄今为止，仅报道了八种日本鳗鱼的AMPs，包括AJN-10[25]、AjCath I（Cathelicidin家族）、Ajdefensin1和Ajdefensin2（β-防御素家族）、AJLEAP-2（肝脏表达的抗菌肽2）、AJBPI-1和AJBPI-2（杀菌/通透性增加蛋白，BPI超家族）以及AJHbα[26]。其中，只有AJN-10和AJHbα对E. tarda具有抗菌活性。然而，这些AMPs对E. tarda的体内抗菌效果仍有待确定。近年来，开发新型AMPs作为治疗病原体感染的潜在抗生素替代品引起了越来越多的关注，但关于E. tarda相关疾病的研究仍然有限[27]。因此，探索日本鳗鱼中的新AMPs具有重要的科学意义，这将有助于更好地理解它们的免疫防御机制，并为开发抗菌剂提供理论基础。

在这项研究中，我们通过分析感染了E. tarda的A. japonica的转录组数据库，鉴定出一个新的功能基因，命名为Anguinin。通过RACE PCR确定了Anguinin基因的完整cDNA序列，并分析了其在健康鳗鱼中的组织分布以及在E. tarda感染后的诱导表达模式。此外，基于Anguinin的理化性质和AMP数据库的预测，我们筛选并获得了一种具有潜在抗菌活性的截短肽Anguinin_55–72。对其进行了化学合成，并确定了其抗菌特性和作用机制。首先，我们使用感染了E. tarda的斑马鱼模型研究了Anguinin_55–72的体内效果，通过检查鱼的存活率来进行评估。进一步，我们构建了A. japonica感染E. tarda的模型，通过确定鳗鱼的存活率、疾病相关指标和细菌清除情况，以及使用qPCR和HE染色分析肝脏组织中的炎症相关基因（包括IL-6、IL-8和TNF-α），来评估Anguinin_55–72的抗菌效果。本研究重点评估了新型AMP Anguinin_55–72的体外抗菌效力，并阐明了其在体内对抗E. tarda感染中的作用，为未来开发有效的抗菌剂提供了理论基础，以替代抗生素在水产养殖中的使用。

部分片段

动物、菌株和细胞系

日本鳗鱼（30±5克）来自中国广州市南沙区的一家批发水产品农场。它们在28°C的恒温循环系统中经过连续7天以上的适应和氧气供应。然后解剖健康的日本鳗鱼，收集包括大脑、心脏、脾脏、鳃、肠道、皮肤、胃、肌肉、肝脏和躯干肾脏在内的各种组织样本。

标准斑马鱼（Danio rerio）的AB菌株，体重约为

Anguinin和截短肽的序列分析及设计

我们利用参考我们实验室先前建立的日本鳗鱼（A. japonica）转录组数据库，通过RACE PCR成功克隆了一个新的功能基因的完整cDNA序列，命名为Anguinin（Genbank登录号PP826360）。该基因由320 bp的5′ UTR、432 bp的3′ UTR和300 bp的开放阅读框（ORF）组成（图1A）。Anguinin的ORF编码一种99个氨基酸的蛋白质，与Anguilla中的两个未鉴定功能基因具有高度序列相似性

讨论

细菌病原体是水产养殖业中多种疾病的罪魁祸首，占所有报告病例的约34%[43]。特别是在鳗鱼疾病中，细菌感染被认为是最严重的，发病迅速，常常导致养殖鳗鱼损失高达90%[44]。在这些病原体中，E. tarda是对鳗鱼构成重大威胁的细菌，会导致系统感染和显著的死亡率[45]。受感染的鱼类表现出

结论

总结来说，我们在日本鳗鱼中鉴定出一个新的功能基因，并将其命名为Anguinin_55–72，它表现出广谱抗菌活性。Anguinin_55–72可以破坏细菌的细胞膜，从而增加膜通透性并诱导ROS的积累，最终导致细菌细胞死亡。此外，Anguinin_55–72还能够

CRediT作者贡献声明

郑文斌：撰写——原始草稿、验证、方法学、研究、正式分析、数据管理。陈芳怡：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。于文豪：方法学、研究。高婷婷：方法学、研究。严子源：方法学、研究。白玉琪：研究。孙航：研究。王克健：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、资金

伦理批准

所有鱼类实验均获得了厦门大学实验动物伦理委员会的批准，参考编号为XMULAC20240211，并遵循当地关于研究动物使用的法规进行。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本研究得到了多项资助，包括国家自然科学基金（资助编号42376089）、福建省海洋与渔业局（资助编号FJHYF-L-2025-13）、福建省产学研合作项目（资助编号2025N5001）和厦门市海洋发展局（资助编号22CZP002HJ08）。此外，本研究还得到了厦门大学海洋环境科学国家重点实验室的博士奖学金支持。我们还要感谢实验室