《Bioorganic Chemistry》：H?S-Activatable dual-responsive fluorescent probe for bicolor visualization of Ferroptosis and drug-induced liver injury models
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氢硫酸双通道荧光探针HAR-H?S用于快速灵敏检测环境与生物样本中的H?S，具有26.4 nM和35.1 nM低检测限、126 nm大光谱分离及3分钟内响应速度，成功应用于水样及HeLa、HepG2细胞、斑马鱼胚胎、铁死亡模型和肝组织切片的生物成像与定量分析。
张雪|侯鹏|张琦|王海军|崔红霞|刘立坤|齐鹏飞|任浩青|侯慧玲|陈松
齐齐哈尔医科大学药学院，中国齐齐哈尔，161006
摘要
硫化氢（H?S）在环境和生物系统中具有双重作用。尽管它是一种天然的大气成分和酶促产生的信号分子，但高浓度的H?S与空气污染、细胞毒性和多种疾病有关。目前检测H?S的方法通常受到复杂样品制备、低灵敏度和选择性不足的限制。为了解决这些问题，我们开发了一种新型的双通道双响应荧光探针HAR-H?S，能够在环境和生物环境中快速、灵敏且选择性地检测H?S。该探针使用香豆素和萘酰亚胺衍生物作为荧光报告分子，并结合了特异性H?S检测的双识别位点。与H?S相互作用时，探针会产生不同的蓝色和绿色荧光信号，从而实现双色成像。实验表明，HAR-H?S具有优异的选择性、低检测限（26.4 nM和35.1 nM）、较大的光谱分离度（126 nm）以及快速的响应时间（小于3分钟）。HAR-H?S已成功应用于水样（自来水、河水和湖水）中H?S的定量检测，以及多种生物系统（包括HeLa细胞、HepG2细胞、斑马鱼胚胎、铁死亡模型和小鼠肝组织切片）中H?S的成像。我们的结果凸显了HAR-H?S作为H?S检测和成像工具的潜力，推动了H?S研究领域的发展。
引言
药物性肝损伤（DILI）是最常见的肝损伤类型之一，已成为一种常见的临床肝病和全球公共卫生问题[1]。它是由药物或其代谢物在肝脏代谢过程中引起的[2]。在此过程中，可能会产生多种反应性中间体，这些中间体通过复杂的信号通路影响肝细胞的健康[3]。在DILI的发病机制中，氧化还原状态失衡尤为显著，表现为活性硫物种（RSS）和活性氧物种（ROS）等的异常表达[4],[5]。RSS包括H?S、半胱氨酸（Cys）、谷胱甘肽（GSH）和同型半胱氨酸（Hcy），在维持细胞氧化还原平衡中起着关键作用[6]。其中，H?S是最小的天然硫醇分子，也是继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后的第三种气体信号分子[7],[8],[9]。H?S主要位于细胞质和线粒体中，通过涉及半胱氨酸及其衍生物的酶促途径内源性合成[10],[11],[12],[13]。在生物系统中，H?S参与多种生理过程，包括抗炎反应[14],[15],[16]、血管扩张[17]和神经调节[18]等。肝脏作为H?S的关键调节部位，对内源性和外源性H?S的高浓度特别敏感[19]。高浓度的H?S可被肝线粒体酶氧化，导致组织缺氧并加重肝损伤[20],[21]。此外，铁死亡（一种依赖铁的非凋亡性程序性细胞死亡）最近被揭示，其与细胞内氧化还原稳态的失调密切相关[22],[23]。铁死亡的核心机制涉及细胞内脂质过氧化和ROS的积累，细胞内H?S水平的波动可能作为细胞抗氧化反应的指标[24]。细胞水平的H?S生理浓度范围为0.01至3 μM，而在氧化应激或药物诱导的损伤下，细胞内H?S水平可显著升高至100 μM甚至更高[25],[26]。此外，H?S主要通过生物降解和地热活动等自然过程释放，这些过程是大气中硫化合物的主要来源；同时，它也是工业排放中的有害气体[27],[28]。例如，造纸和染料行业的废弃物分解会显著增加H?S的释放[29]。这种气体浓度与环境污染直接相关，长期暴露于高浓度的H?S会对人类健康构成潜在风险[30],[31]。根据中华人民共和国国家卫生健康委员会的规定（GBZ2.1–2019），工作场所空气中H?S的允许浓度为10 ppm（15 mg/m3）。鉴于这些因素，准确检测H?S不仅对早期诊断肝病至关重要，而且对于评估护肝药物的效果和评估环境样本也具有重要的实际价值。
传统的H?S检测方法，如气相色谱法、电化学测定法、比色法和硫化物沉淀法，通常需要复杂的样品制备过程，并可能破坏组织或细胞的完整性[32],[33],[34]。相比之下，基于荧光的技术提供了一种非侵入性、高分辨率的方法，用于体内生物物种的监测。过去十年中，人们投入了大量精力开发H?S检测荧光探针（见表S1）。然而，大多数探针主要依赖于单通道和单识别位点的荧光激活机制。考虑到生物环境的复杂性，单通道和单识别位点荧光探针的选择性往往不足，且其对环境干扰的抵抗力较弱。它们的荧光强度容易受到复杂环境条件引起的假阳性或人为干扰的影响。相比之下，双通道双响应荧光探针利用两个独立的通道进行检测过程，每个识别位点都经过精心设计，以高度特异性地识别目标分子。这种设计使得相互验证成为可能。如果一个通道检测到信号变化，另一个通道可以有效地确认这一变化，从而显著减少假阳性结果的发生。此外，这类探针对环境干扰的抵抗力更强，从而为体内生物物种的监测提供更可靠和准确的结果。
目前，虽然大多数用于研究DILI的荧光探针都是由APAP诱导的，但对于其他药物引起的肝损伤的研究仍然有限。本文设计了一种合理设计的双通道双响应荧光探针HAR-H?S，用于特异性检测和成像H?S。选择香豆素和萘酰亚胺衍生物作为荧光团，并引入2,4-二硝基苯氧基和叠氮基团作为H?S特异性识别位点。当被H?S激活时，2,4-二硝基苯氧基团发生亲核芳香取代反应，产生来自香豆素衍生物HAR-CN的蓝色荧光信号；同时，叠氮基团被还原形成氨基，触发萘酰亚胺衍生物中的ICT（分子内电荷转移）过程，产生明显的绿色荧光。这种双通道设计实现了快速、灵敏和选择性的H?S检测。HAR-H?S已成功应用于自来水、河水和湖水中H?S的定量检测，以及在多种生物模型（包括HeLa细胞、HepG2细胞、斑马鱼胚胎、铁死亡模型和小鼠肝组织切片）中的H?S成像。这些结果不仅为H?S介导的肝损伤机制提供了新的见解，还展示了HAR-H?S在生物成像应用中的潜力。
HAR-H?S的光谱测量
通过将不同的分析物（包括目标物质H?S和各种潜在干扰物F?、Br?、Cl?、Na?、Ag?、Fe2?、HSO??、HCO??、HPO?2?、HSO??、CO?2?、SO?2?、NO??、SO?2?、PO?3?、ClO?、NO??、ONOO?、H?O?、NO、O??、OH?、1O?、Cys、Hcy和GSH）溶解在超纯水中，制备了浓度为1.0 mM的储备溶液。本实验中使用的H?S供体是硫化氢钠（NaHS，购自中国上海Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.，纯度≥98%）。
HAR-H?S的设计策略
香豆素衍生物因其广泛应用于检测生物活性物质和成像细胞过程而受到广泛关注，其出色的生物相容性和组织穿透能力进一步增强了这些特性[35],[36]。同时，基于萘酰亚胺的分子传感器因其优异的光物理性质（如高量子产率和消光系数）而受到认可[37],[38],[39]。
结论
通过利用双识别位点和双通道荧光机制，HAR-H?S在H?S检测中表现出显著的灵敏度、选择性和较大的光谱分离度以及快速的响应时间。该探针与H?S相互作用时能够产生不同的蓝色和绿色荧光信号，从而实现复杂生物和环境基质中的实时监测和定量分析。HAR-H?S已在多种应用中得到了成功验证。
CRediT作者贡献声明
张雪：撰写初稿、软件开发、数据管理、概念构思。侯鹏：资源获取、项目管理、资金筹措、正式分析。张琦：验证、方法学研究、实验设计。王海军：可视化处理、验证、实验设计。崔红霞：可视化处理、验证。刘立坤：验证、数据管理。齐鹏飞：软件开发、方法学研究。任浩青：验证、概念构思。侯慧玲：验证、监督。陈松：撰写修订稿
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
我们衷心感谢黑龙江省省级本科院校优秀青年教师基础研究支持计划（编号：YQJH2024285）、齐齐哈尔医学科学院基金（编号：QMSI2024Z-10）、黑龙江省自然科学基金（编号：LH2023H098）以及齐齐哈尔医科大学优势特色学科建设项目（编号：QYZDXK-008）的财政支持。
