《Biosensors and Bioelectronics》：Intracellular DNA network assembly triggered by microRNA and telomerase for imaging-guided STING hyperactivation
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本研究设计了一种基于miRNA和端粒酶的双标志物激活的DNA纳米平台（DiG-DNA），通过miRNA-155响应的催化发夹结构（CHA）和端粒酶激活的线性双链DNA（LL-DNA）的协同作用，在肿瘤细胞内组装成高密度三维DNA网络（N-DNA），实现cGAS-STING通路的高效激活与实时荧光成像。该平台利用AND逻辑门控机制，严格依赖肿瘤细胞过表达的miRNA-155和端粒酶双重生物标志物，确保特异性激活并减少系统性毒性，为影像引导的精准癌症免疫治疗提供新范式。
作者：程雅茹、冯友明、隋雷、杨双双、高壮强、刘青、卢慧婷、董海峰
单位：深圳大学医学院生物医学工程学院精准医学与健康研究所生物医学工程马歇尔实验室、深圳纳米生物传感技术重点实验室，中国深圳518060
摘要
尽管cGAS-STING激活在癌症免疫治疗中具有巨大潜力，但其临床应用受到非特异性激活和相关脱靶毒性的严重限制。本文设计了一种由微小RNA（miRNA）和端粒酶触发的细胞内DNA网络组装策略，实现了基于成像的STING超激活。该纳米平台（DiG-DNA）由miRNA响应的发夹DNA（H1–H3）和可被端粒酶激活的线性双链DNA（LL-DNA）组成。在正常细胞中，该平台保持沉默状态；但在过表达miRNA-155和端粒酶的肿瘤细胞中，它会经历级联激活。miRNA-155启动催化性发夹组装（CHA），而端粒酶驱动链延长；这两个过程共同释放DNA成分，在癌细胞内形成密集的三维DNA网络（N-DNA）。整个组装过程通过多重荧光恢复（Cy3/Cy5）技术进行实时监测，为验证激活效果和指导后续治疗提供了成像依据。原位形成的N-DNA作为强效的cGAS激动剂，促进液-液相分离（LLPS），从而实现强烈的STING激活和抗肿瘤免疫效应。这种基于内源性生物标志物的细胞内组装策略具有高度的空间特异性，这在体内实验中得到了验证。因此，它为基于成像的精准控制癌症免疫治疗提供了新的范式。
引言
癌症免疫治疗通过利用宿主的先天免疫系统来靶向和清除恶性细胞，近年来彻底改变了癌症治疗模式（Gao等人，2025；Gong等人，2025；Li等人，2021；Xue等人，2024）。作为先天免疫系统的核心组成部分，环状GMP-AMP合成酶-干扰素基因刺激因子（cGAS-STING）信号通路在肿瘤免疫治疗中起着重要作用。该通路作为双链DNA（dsDNA）的关键胞质传感器，能够强烈触发I型干扰素（IFN）和促炎细胞因子的产生，从而协调抗肿瘤免疫反应（Decout等人，2021；Li等人，2022，2025）。机制上，cGAS在结合长dsDNA时表现出强烈的长度依赖性激活，催化关键第二信使2′,3′-环状GMP-AMP（cGAMP）的合成（Ablasser等人，2013；Andreeva等人，2017；Civril等人，2013）。cGAMP随后激活STING，引发下游转录级联反应，最终释放IFN-β并产生强烈的抗肿瘤免疫效应（Wu和Chen，2014）。因此，针对性激活cGAS-STING通路是癌症免疫治疗的一个极具前景的策略。尽管小分子STING激动剂在临床前研究中显示出良好效果（Sun等人，2021；Wang等人，2025a；Wang等人，2024），但其临床应用受到剂量依赖性的脱靶炎症、全身毒性和肿瘤特异性不足的限制（Chen等人，2023，2024）。这些挑战凸显了迫切需要能够在肿瘤细胞内实现精确时空控制的STING激活策略。
DNA纳米技术提供了一种强大的解决方案，利用可编程的沃森-克里克碱基配对原理，以无与伦比的精确度和可控性设计纳米结构（Wang等人，2025b；Yao等人，2025）。这种可编程性使得能够构建适用于多种生物医学应用的定制结构，特别是在靶向免疫调节方面（Jiang等人，2021；Shaikh等人，2022）。迄今为止，已经使用了预组装的DNA结构（如干扰素刺激DNA和病毒DNA模拟物）来递送免疫刺激dsDNA并激活cGAS-STING通路（Xu等人，2023；Zhang等人，2023）。然而，这些方法的系统性给药往往导致正常细胞或健康组织的非特异性摄取和过早激活，从而削弱了治疗选择性。光响应方法通过紫外线（UV光）暴露诱导细胞内组装来实现时空控制（Yu等人，2023），但它们依赖于外部照射，组织穿透能力有限。因此，设计完全内源性的、分子驱动的系统，在肿瘤细胞内启动DNA自组装对于实现肿瘤特异性和精确的时间控制至关重要。
由于内源性肿瘤生物标志物在癌症中的差异性表达及其在细胞内的固有存在，它们成为智能STING激活系统的理想触发因子。特别是微小RNA（miRNA）具有高肿瘤特异性和稳定性（Wu等人，2025；Yang等人，2023）。尽管早期研究展示了使用单个生物标志物（例如miRNA-21）来启动细胞内DNA组装以实现局部STING激活（Morihiro等人，2023），但这类单输入系统缺乏区分具有基础生物标志物表达的癌细胞和正常组织的特异性，存在脱靶风险。同时，新兴证据表明，长而高度浓缩的dsDNA优先诱导cGAS的液-液相分离（LLPS），显著增强cGAS酶活性和下游STING信号传导（Hopfner和Hornung，2020；Wu等人，2023）。端粒酶活性——几乎所有癌细胞的共同特征——可以用来在原位延长DNA链，进一步增加局部dsDNA浓度（Dai等人，2023；Han等人，2024）。将miRNA介导的启动与端粒酶驱动的延长相结合，从而能够在肿瘤细胞内形成高密度的DNA网络，最大化LLPS驱动的cGAS激活，并严格限制免疫刺激的空间范围。据我们所知，目前还没有平台同时结合这两种内源性信号来构建用于选择性、高效ST激活的密集DNA结构。
为了解决这些问题，我们报道了一种逻辑门控的DNA纳米平台，该平台能够通过双重miRNA和端粒酶触发细胞内DNA网络组装，实现基于成像的STING超激活（图1）。该系统的核心是一个AND逻辑电路，需要同时识别两个肿瘤生物标志物：过表达的miRNA-155和增强的端粒酶活性。这一逻辑门通过两个协同模块进行分子编码：（1）miRNA-155响应的催化性发夹DNA电路（HP-DNA，包含H1–H3），其中H1携带Cy3/BHQ2荧光团-淬灭对，用于实时荧光检测；（2）可被端粒酶激活的线性长DNA（LL-DNA），标记有Cy5并通过BHQ3淬灭，用于正交成像输出。cGAS-STING通路的激活严格限制在表达这两种生物标志物的细胞中。miRNA-155触发催化性发夹组装（CHA）反应，形成Y形DNA（Y-DNA）结构并恢复Cy3荧光信号。同时，端粒酶延长LL-DNA上的引物，引发链置换反应（SDR），释放线性DNA激活剂（LA-DNA），导致Cy5荧光恢复。生成的Y-DNA和LA-DNA通过序列互补性杂交，在肿瘤细胞内原位形成三维治疗性DNA纳米结构（N-DNA）。这种架构确保了高保真的、生物标志物门控的STING激活，并具有内置的诊断输出。
这种细胞内组装的N-DNA具有双重治疗诊断作用：它通过Cy3和Cy5荧光提供强大的多重诊断信号，实现生物标志物共表达和治疗性纳米结构的实时可视化。同时，N-DNA作为强效的cGAS激动剂，其优化的尺寸和结构促进了cGAS的有效招募，增强了LLPS，从而增强了酶活性，进而诱导强烈的肿瘤选择性STING超激活。需要注意的是，在炎症条件下，miRNA-155可以在活化的免疫细胞中诱导表达，这可能引发单输入响应系统中的脱靶激活问题。这里采用的AND门架构通过引入第二个正交要求——端粒酶活性——显著降低了这一风险，因为端粒酶活性在大多数正常体细胞和免疫细胞中几乎不存在。因此，只有当两个细胞内信号同时满足时，才会形成有效的N-DNA网络并引发下游cGAS-STING超激活，从而在复杂的生理环境中提高肿瘤选择性。这种双重关键激活策略确保了空间和激活的特异性，有效消除了传统激动剂和单输入系统的脱靶效应。通过将精确的肿瘤诊断与强大的局部免疫效应相结合，我们的逻辑门控DiG-DNA纳米平台为开发智能的下一代癌症免疫治疗建立了全新的范式，提供了高特异性和良好的治疗效果。
DNA系统的制备
DNA系统由两部分组成：1）三个发夹结构：H1、H2和H3；2）由四种单链DNA（S1、S2、S3、S4）杂交形成的长线性双链DNA（LL-DNA）。具体来说，H1、H2或H3用HBS缓冲液（25 μM HEPES、150 mM NaCl、5 mM MgCl2，pH 7.4）稀释至10 μM，并在95°C下退火5分钟。然后，将溶液冷却至室温以供进一步使用。为了合成LL-DNA，需要...
miRNA和端粒酶触发N-DNA自组装的研究
虽然miRNA-155在所有癌症类型中并不均匀过度表达，但它经常在多种实体瘤和免疫炎症性肿瘤微环境中上调，这些领域正在积极探索基于STING的免疫治疗。重要的是，miRNA-155是一种代表性的细胞内调节miRNA，与炎症和干扰素相关信号传导密切相关。在本研究中，miRNA-155被用作模型触发因子，以证明逻辑门控细胞内DNA...
结论
总之，我们开发了DiG-DNA，这是一种双生物标志物门控的纳米平台，能够实现肿瘤特异性的cGAS-STING通路激活。该系统的核心设计是一个对miRNA-155和端粒酶响应的AND逻辑电路，确保了密集DNA网络（N-DNA）的精确细胞内自组装，并通过多重荧光进行实时可视化。形成的N-DNA有效促进了cGAS的液-液相分离，从而实现了强烈的STING激活和抗肿瘤效应...
注释
作者声明没有竞争性财务利益。
CRediT作者贡献声明
程雅茹：概念构思、数据管理、资金获取、研究、初稿撰写。
冯友明：数据管理、研究。
隋雷：数据管理、研究、方法学。
杨双双：软件开发、验证。
高壮强：资金获取、可视化。
刘青：资金获取、监督。
卢慧婷：撰写、审稿与编辑。
董海峰：资金获取、撰写、审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了以下机构的财务支持：深圳市科技创新计划（JCYJ20250604181726035）、国家自然科学基金（22374102）、国家重点研发计划（2023YFA0915700）、中国博士后科学基金（2024M752101）、深圳市医学研究基金（D2301011）、广东省珠江人才计划（2021ZT09C289）以及国家自然科学基金（82202338、32471514）。
