《Cellular Immunology》：Identification and validation of hub genes associated with neutrophil immunosuppression during Sepsis
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本研究通过整合生物信息学和实验验证，利用WGCNA分析GEO数据库中的中性粒细胞转录组数据，结合单细胞RNA测序和CLP小鼠模型，发现NFKBIZ、TNFAIP2和CTSS是调控脓毒症中中性粒细胞免疫抑制的关键基因，其动态表达揭示了免疫功能障碍的机制，为逆转脓毒症免疫抑制提供了潜在治疗靶点。
张睿|康宇|刘红梅|潘鹏|胡晓涵|徐云云|王江淮|王健
苏州大学儿童医院儿科临床研究所，江苏苏州215000，中国
摘要
目的
败血症涉及从过度炎症到免疫抑制的转变，中性粒细胞在这两个阶段都起着核心作用。然而，中性粒细胞驱动的免疫抑制的分子基础仍不清楚。本研究旨在识别并验证调节败血症中性粒细胞免疫抑制的枢纽基因，以发现潜在的治疗靶点。
方法
利用WGCNA分析了GEO数据库中的中性粒细胞转录组数据集（GSE64457、GSE180387），以识别与败血症进展相关的模块，随后进行GO/KEGG富集和PPI网络构建。通过人类外周血中性粒细胞的单细胞RNA测序验证了候选枢纽基因。进一步使用盲肠结扎和穿刺（CLP）小鼠败血症模型，通过CD4+ T细胞共培养实验评估中性粒细胞介导的免疫抑制，并通过Western blot分析和qPCR确认枢纽基因的表达。
结果
WGCNA识别出与败血症进展密切相关的免疫相关模块，这些模块在细胞因子信号传导、免疫受体活性和中性粒细胞脱颗粒方面富集。交集分析发现了34个共同基因，PPI网络优先考虑了三个枢纽基因：NFKBIZ、TNFAIP2和CTSS。单细胞分析显示这些枢纽基因在免疫抑制性中性粒细胞和非免疫抑制性中性粒细胞中的表达存在差异。在CLP模型中，晚期中性粒细胞（第5天）显著抑制了CD4+ T细胞的增殖（p<0.01）。蛋白质验证证实了晚期败血症中NFKBIZ的上调以及TNFAIP2和CTSS的下调。
结论
综合生物信息学和实验验证确定了NFKBIZ、TNFAIP2和CTSS是败血症中性粒细胞免疫抑制的潜在调节因子。它们的动态表达突出了与免疫功能障碍相关的关键机制特征，并为逆转败血症引起的免疫麻痹提供了新的靶点。
引言
败血症是一种由宿主对感染的反应失调引起的危及生命的综合征，仍然是全球重症监护病房的主要死亡原因[1]。尽管重症监护技术的进步提高了早期生存率，但许多败血症患者仍经历持续的免疫抑制，表现为免疫细胞功能受损和继发感染易感性增加，这显著影响了长期预后[2]。
中性粒细胞作为先天免疫防御的第一道防线，在败血症中发挥着双重作用。在感染早期，它们通过吞噬作用、脱颗粒和形成中性粒细胞外陷阱（NETs）等机制清除细菌[3]。虽然在感染急性期对病原体清除至关重要，但它们也会引发过度炎症并导致随后的免疫抑制[4]。除了趋化性受损等功能缺陷[5]外，晚期败血症中的中性粒细胞功能障碍还因造血系统的病理变化而加剧。骨髓中髓系细胞的分化途径发生显著改变，导致抑制性中性粒细胞的生成增加，超过其常规成熟中性粒细胞[6]。这种免疫抑制性细胞的扩增进一步减少了T细胞和淋巴细胞的数量，这是败血症中免疫衰竭的关键特征[7]。然而，这种表型变化的机制尚不明确，限制了有效免疫调节疗法的开发。
在这项研究中，我们采用了一种综合的多组学策略来揭示败血症中性粒细胞功能障碍的分子基础。通过对公开可用的败血症中性粒细胞转录组数据集进行加权基因共表达网络分析（WGCNA），识别了与免疫相关的基因模块和候选枢纽基因。这些发现通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据、跨亚型表达分析以及小鼠败血症模型中的实验验证得到了进一步验证。我们确定了三个可能参与中性粒细胞免疫抑制功能的枢纽基因：NFKBIZ、TNFAIP2和CTSS。我们的结果为中性粒细胞功能障碍提供了机制上的见解，并强调了逆转败血症引起的免疫麻痹的潜在治疗靶点。
数据集
微阵列数据集（GSE64457和GSE180387）来自基因表达组学数据库（GEO）。
GSE64457包括9名具有败血症诱导的免疫抑制的败血症休克患者（在D3–4和D6–8采集样本）和8名健康对照组[8]。GSE180387包括11名败血症休克患者在ICU入院后12小时内和5天内的RNA-seq谱型。其中5名患者在两个时间点都提供了匹配样本[9]。所有样本、访问编号和配对信息
GSE64457数据集的WGCNA分析
经过数据预处理后，没有样本因层次聚类而被排除（图1A）。首先确定最佳软阈值功率来构建无尺度共表达网络。选择β=6作为最低值，该值能够获得无尺度拓扑拟合指数（R2）>0.85（图1B-C），同时保持相对较高的平均连通性。基因被聚类成不同的共表达模块，然后通过动态树切割合并这些模块
讨论
尽管急性护理技术有所进步，败血症仍然是全球发病率和死亡率的主要原因，持续的免疫抑制导致长期预后不佳[1]。中性粒细胞作为宿主防御的核心，在败血症期间会发生显著表型变化，从过度炎症状态转变为功能失调的免疫抑制状态[15],[16]。在败血症中，中性粒细胞早期形成的NETs有助于限制感染[3]，而随后的
结论
通过综合转录组分析和实验验证，本研究确定了三个枢纽基因NFKBIZ、TNFAIP2和CTSS是败血症中性粒细胞免疫抑制的中心调节因子。NFKBIZ的上调和TNFAIP2及CTSS的下调与晚期败血症中抑制T细胞增殖的中性粒细胞表型相关。这些枢纽基因为免疫麻痹的机制提供了见解，代表了
作者贡献
所有作者都参与了研究的构思和设计。R.Z.和Y.K.对本手稿的贡献相当。R.Z.和Y.K.负责材料准备和数据收集。H.L.进行了数据分析。P.P.和X.H.参与了模型构建。J.W.和Y.X.参与了研究的构思或设计。手稿的第一稿由R.Z.和J.H.W.撰写。所有作者都对手稿的早期版本进行了评论，并阅读并批准了最终版本。
CRediT作者贡献声明
张睿：撰写——初稿，数据管理。康宇：可视化，形式分析。刘红梅：数据管理。潘鹏：验证。胡晓涵：验证。徐云云：项目管理，概念构思。王江淮：撰写——审阅与编辑。王健：监督，资金获取。
伦理批准
本研究中的所有实验均经过苏州大学伦理委员会（SUDA 20231228A01）的审查和批准。
资助
本工作得到了国家自然科学基金（82,572,498, 82272215）和江苏省自然科学基金（BK20251797）的支持。此外，还得到了苏州市科技计划项目（SYW2025119）和临床儿科学院2025年学生研究项目（编号A02）的支持。以及苏州市科技计划项目（SYW2025032）和苏州市儿科罕见病临床医学中心（Szlcyxzxj202105）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。
