《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：ERG/DOTAP modulation of Physiological Response to AIE-Visualized Nanoliposomes is dominated by Protein Corona
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脂质纳米颗粒作为药物递送系统因优异生物相容性和高包封率备受关注。本研究通过自合成AIE荧光纳米粒子R1构建可视化载体R1@Lip，系统研究脂质成分（胆固醇/ergosterol）和阳离子脂质DOTAP比例对肝肺靶向的影响。质谱分析揭示8% DOTAP的胆固醇基脂质体增强肝靶向蛋白表达，而30% DOTAP的ergosterol基脂质体R1@Lip-4实现肝靶向富集率55.4%，较胆固醇基体提升显著。该研究首次建立"脂质体-蛋白冠-组织靶向"调控关系，为靶向递送系统设计提供新范式。
陈凯毅|丁美红|卢莎莎|周宇|叶玉萌|余波|谢妮|程桂林
浙江中医药大学药学院，中国杭州310035
摘要
脂质纳米颗粒（Lips）因其优异的生物相容性、低毒性和高包封效率而被研究作为药物输送系统。通过调整材料组成和功能基团，可以调控其大小、电荷和亲水性，以实现针对特定组织的分布。在生物环境中，Lips会吸附蛋白质形成“蛋白质冠层（PC）”，从而改变其物理化学性质和生物相互作用。然而，PC调节Lips组织靶向的机制仍不清楚，这主要是由于体内荧光定量不准确和稳定性较差所致。为了追踪Lips在体内的命运，我们以自合成的聚集诱导发光荧光纳米颗粒（AIEgen R1）为模板，并用不同材料组成的Lips对其进行包封，制备出可视化的纳米脂质体R1@Lip。与使用胆固醇（CHOL）作为膜材料的脂质体相比，基于麦角固醇（ERG）的R1@Lip-4在肝脏中的荧光信号强度为55.4%，在肺组织中的信号强度为13.3%，显示出更强的肝脏靶向性。体外实验验证了这种组织选择性。蛋白质组学分析表明，8%的DOTAP含量增加了肝脏靶向蛋白（如TRFE、FIBA）的表达，而30%的DOTAP含量则增强了肺组织靶向蛋白（如ANXA1和PDLI1）的表达。用ERG替代CHOL后，肺组织靶向蛋白减少，而肝脏靶向蛋白增加。这表明含有30%阳离子的R1@Lip-4在肝脏中的分布更广。这些发现建立了“R1@Lip-PC-组织靶向”关系，通过调节Lip的配方可以精确控制PC的性质，从而提高组织靶向性。
引言
脂质纳米颗粒（Lips）是由胆固醇（CHOL）和天然无毒磷脂组成的超分子聚集体[1]、[2]。由于其出色的生物相容性、生物降解性和包封效率，Lips被认为是携带DNA、mRNA和siRNA等核酸的理想载体[3]。其独特的脂质双层结构使Lips能够输送亲水性和疏水性药物[4]、[5]。作为Lips配方中常用的甾醇，CHOL能有效防止膜聚集并增强脂质体膜的稳定性。真菌甾醇（如麦角固醇（ERG）也常用于脂质体的制备[6]、[7]。通过改变Lips的表面性质和组成，可以制造出多种类型的Lips，从而提高稳定性并减少药物对健康细胞的副作用[8]。
当Lips进入复杂的生物环境时，会在其表面形成“蛋白质冠层（PC）”——这是一种动态的蛋白质层。这不仅仅是简单的物理吸附，而是通过改变Lips的表面物理化学性质，重塑了其与细胞、组织和免疫系统的相互作用，影响Lips在体内的命运以及Lip-蛋白质复合物的循环半衰期和血清稳定性[9]、[10]、[11]、[12]。改变CHOL的含量会增加Lips中的载脂蛋白含量，这主要归因于载脂蛋白与CHOL之间的相互作用。研究表明[13]、[14]、[15]、[16]，通过调整材料组成、比例和功能基团，可以调控Lips的粒径、表面电荷和亲水性。这使得能够精确控制表面PC的组成，从而赋予纳米颗粒不同的组织靶向能力。尽管PC被认为是调控Lips生物行为的关键介质，但其如何影响Lips的组织靶向性仍不清楚。这大大限制了基于PC“功能定制”来优化Lips靶向性的能力。
为了阐明其靶向机制并最大化输送效率，准确的体内追踪和纳米颗粒行为的定量分析至关重要。聚集诱导发光（AIE）染料是一种新型染料，在聚集状态下具有增强的发光性能，亮度高、光稳定性好、生物相容性好，有效避免了传统染料的浓度猝灭问题[17]、[18]、[19]。AIE染料为制备荧光探针提供了创新方法[20]、[21]、[22]，在体内追踪和脂质体标记方面具有巨大潜力。因此，制备AIE荧光纳米颗粒（AIEgen R1）并将其完全用脂质材料包封，可以实现荧光信号的无偏绝对定量。同时，深入分析PC的调控机制将是克服靶向Lip输送瓶颈的关键。
我们筛选了四种Lips配方，并成功将AIEgen R1包封其中。通过改变粒径、电荷和长循环性能，确认了R1@Lip的有效构建。通过使用不同膜组成和阳离子比例的R1@Lip进行体内成像实验，评估了其肝脏和肺部的靶向能力。此外，使用肝细胞AML-12和肺上皮细胞TC-1作为模型，通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术研究了不同R1@Lip和R1@Lip-PC配方对细胞摄取的影响。结果表明，不同R1@Lip-PC配方在AML-12和TC-1细胞中的摄取趋势与R1@Lip一致。因此，分析R1@Lip表面PC的形成机制有助于建立“R1@Lip-PC-组织靶向”相互作用。本研究的主要目的是优化R1@Lip的脂质配方，以调节PC的性质，从而显著提高其组织靶向能力。这项研究不仅为基于PC调控设计智能靶向纳米系统提供了新策略，还为开发纳米颗粒靶向输送的大数据方法奠定了坚实基础。
材料
用于制备脂质纳米颗粒的高纯度氢化大豆磷脂（HSPC）、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（DSPE-mPEG2000）、胆固醇（CHOL）和（2,3-二油氧基丙基）三甲基铵氯化物（DOTAP）由Avtopharm（中国上海）提供；麦角固醇（ERG）和脂多糖（LPS）则从Yuanye（中国上海）采购；磷钨酸负染色溶液也用于实验。
脂质纳米颗粒的优化与测定
为了获得性能最佳的脂质纳米颗粒（Lips），我们对膜组成进行了系统研究。具体来说，在保持DOTAP含量分别为8%和30%的条件下，系统地调整了CHOL/ERG的摩尔比。如表S1和S2所示，当DOTAP含量为8%时，CHOL/ERG比例为35%时，获得了最佳的粒径均匀性和可预测的ζ电位分布。
讨论
在这项研究中，我们基于自主研发的AIEgen R1构建了一个可视化的纳米输送系统R1@Lip。通过利用AIE的固有优势，我们克服了传统染料的局限性，如泄漏和定量不明确的问题[21]、[50]。从而阐明了“R1@Lip-PC-组织靶向”之间的功能关系。本研究揭示了使用ERG与CHOL以及通过DOTAP摩尔比调节表面电荷在调控体内行为中的关键作用。
结论
为了研究Lips的靶向特异性，我们成功将自合成的AIEgen R1与四种优化后的Lips配方进行包封，制备出了可视化的R1@Lip。通过调节脂质组成（CHOL/ERG）和R1@Lip中的阳离子含量，显著改变了它们的生物分布。将DOTAP含量从8%增加到30%减少了肝脏积累，同时增强了肺部沉积。而基于ERG的R1@Lip-4在肝脏中表现出明显的靶向偏好。
资助
本研究未获得公共部门、商业机构或非营利组织的任何特定资助。
CRediT作者贡献声明
叶玉萌：方法学研究。周宇：可视化、研究。谢妮：写作——审稿与编辑、项目管理、方法学研究、资金获取、数据分析、概念构思。余波：方法学研究。程桂林：写作——审稿与编辑、初稿撰写、监督、项目管理、方法学研究、资金获取、概念构思。丁美红：写作——审稿与编辑、监督、方法学研究。
利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
