《Cytokine》：Combination therapy with amphotericin B and Ultradiluted
Leishmania donovani antigen skews cytokine balance towards protective immunity in visceral leishmaniasis
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本研究通过联合治疗阿莫菲尼定与超稀释利什曼抗原，显著降低实验小鼠肝脾寄生虫负荷，增强Th1免疫应答及巨噬细胞激活，同时减轻药物毒性，为利什曼病治疗提供新策略。
切特娜·班德拉尔（Chetna Bandral）|乔蒂·乔希（Jyoti Joshi）|苏巴什·考希克（Subhash Kaushik）|德巴达塔·奈亚克（Debadatta Nayak）|苏克比尔·考尔（Sukhbir Kaur）
印度昌迪加尔旁遮普大学（Panjab University, Chandigarh 160014）动物学系
摘要
背景
内脏利什曼病（Visceral Leishmaniasis, VL）是一种被忽视的热带疾病，具有高死亡率且治疗选择有限。两性霉素B（Amphotericin B, AmB）仍然是最有效的药物，但其疗效受到剂量依赖性毒性的限制。使用寄生虫衍生成分的免疫疗法可能增强宿主的防御机制和保护反应，并减轻药物引起的细胞毒性。
目的
本研究探讨了在VL小鼠模型中，两性霉素B与超稀释利什曼原虫抗原（ultradiluted Leishmania antigen, udLA）联合使用的疗效及其对免疫反应的调节作用。
方法
BALB/c小鼠被实验性感染利什曼原虫（Leishmania donovani）的前鞭毛体，随后接受两性霉素B、udLA或其联合治疗。通过利什曼-多诺万单位（Leishman–Donovan Units）和定量PCR检测肝脏和脾脏组织中的寄生虫负荷。通过流式细胞术分析CD4
+和CD8
+ T细胞亚群，量化活性氧（ROS）和一氧化氮（NO），并评估iNOS和NF-κB的表达来表征细胞免疫反应。还检测血清细胞因子浓度以确定Th1/Th2极化情况。评估肝脏和肾脏功能的生化指标以评估全身毒性。
结果
所有治疗组均显著降低了寄生虫负荷，其中两性霉素B+udLA组合组的降低幅度最高，达到96%。联合治疗显著增加了CD4
+和CD8
+效应T细胞的数量，增强了ROS和NO的生成，并上调了iNOS和NF-κB的表达，表明巨噬细胞活性增强。细胞因子分析显示Th1反应占主导地位，表现为IFN-γ、TNF-α和IL-17水平升高，同时IL-10、IL-13和IL-27水平降低。重要的是，生化分析表明两性霉素B+udLA组患者的肝脏和肾脏参数得到恢复，表明药物相关性毒性得到缓解。
结论
两性霉素B与超稀释利什曼原虫抗原的联合使用通过增强Th1偏向的免疫反应和激活巨噬细胞效应机制显著提高了抗利什曼病的疗效，同时最小化了药物引起的毒性。这些发现强调了udLA作为管理VL的更安全策略的潜力。
引言
内脏利什曼病（VL），又称黑热病（kala-azar），是一种由利什曼原虫（Leishmania）属的专性细胞内寄生虫引起的严重系统性疾病，主要致病菌为利什曼原虫多诺万种（Leishmania donovani）和利什曼原虫婴儿种（Leishmania infantum）。当吸血雌性沙蝇（属于Phlebotomus属[旧世界]和Lutzomyia属[新世界]）在吸血过程中将处于后期发育阶段的前鞭毛体注入哺乳动物宿主体内时，疾病便会传播[1]。临床上，VL表现为持续发热、体重下降、肝脾肿大、全血细胞减少和免疫抑制，若不治疗通常会导致高死亡率[2]。这种临床严重性在全球疾病负担中有所体现。根据世界卫生组织（WHO）的数据，全球90%以上的VL病例发生在巴西、埃塞俄比亚、印度、肯尼亚、索马里、南苏丹和苏丹[3]。该疾病主要影响热带和亚热带地区的人口。全球每年报告的新病例数约为5万至9万例，但由于诊断和报告方面的挑战，实际疾病负担可能被低估[3]。高死亡率和疾病负担与内脏利什曼病的复杂免疫病理机制密切相关，这种机制涉及寄生虫毒力因子与宿主免疫反应之间的动态相互作用[4]。该疾病的特征是细胞介导的免疫反应显著下调，使寄生虫能够在宿主巨噬细胞内存活和繁殖。此外，VL的临床表现还受到遗传、营养和社会经济因素的影响，凸显了这种被忽视的热带疾病的复杂性[5]。尽管诊断工具和治疗方案有所进步，但VL仍然是一个重大的公共卫生问题，尤其是在资源有限的地区。目前常用的抗利什曼病药物包括两性霉素B、米替福辛（miltefosine）、戊糖苷酸钠（sodium stibogluconate）、葡萄糖酸锑胺（meglumine antimoniate）和脂质体两性霉素B[6]。然而，这些药物存在肾毒性、胰腺炎、心脏毒性、致畸性、耐药性寄生虫的出现、需要长期静脉治疗以及高成本等局限性[7]。鉴于耐药性的日益严重以及缺乏疫苗或有效的媒介控制措施，迫切需要新型、安全且经济有效的治疗策略[6]。在这种情况下，超稀释药物作为一种新的方法在补充和替代医学中脱颖而出。这些药物由生物来源材料合成，直接从微生物、纯化毒素或传染病产物通过系列稀释和震荡处理获得。超稀释剂通常用于治疗感染性和非感染性疾病[8]。多项研究表明，超稀释（顺势疗法）制剂可以调节免疫反应，特别是通过影响巨噬细胞功能、氧化应激和细胞因子生成[9]。高度稀释的汞溶质（Mercurius solubilis，稀释度为6、12、30和200 CH）在体外和体内模型中均能改变巨噬细胞活性，增加一氧化氮（NO）生成和活性氧（ROS）水平，并影响细胞因子释放，尤其是IFN-γ和IL-4[10]。类似地，一种顺势疗法M1复合物通过增强巨噬细胞与利什曼原虫亚马逊种（Leishmania amazonensis）的相互作用，减少了寄生虫负荷并限制了病变发展，从而增加了NO生成并使细胞因子谱向Th1反应偏移，有助于治愈[9]。高浓度锑也报告可以调节细胞因子生成和巨噬细胞与利什曼原虫的相互作用，尽管其对NO和H
2O
2生成的影响因稀释度而异[11]。这些观察结果表明，超稀释剂可能在调节疾病相关的免疫反应方面具有一定的潜力。鉴于当前单一疗法的挑战，特别是毒性和耐药性问题[6]，将此类超稀释制剂纳入现有治疗方案可能提高疗效，减少副作用并增强宿主免疫力，为VL提供一种新的、以宿主为导向的策略[12]。已有许多治疗组合（如脂质体两性霉素B与米替福辛或帕罗莫霉素与锑制剂）在临床实践中显示出潜力[13]。这些药物可能增强免疫反应，降低药物毒性并提供保护。然而，关于这些整合方法的科学证据仍然有限。因此，考虑到超稀释剂的优点和迫切需要新的替代方案，本研究旨在将超稀释利什曼原虫抗原与标准药物两性霉素B结合，以测试其对实验性内脏利什曼病的疗效。
利什曼原虫多诺万种（Leishmania donovani，MHOM/IN/80/Dd8）在NNN培养基和M199培养基中培养，每3天在22 ± 1°C的环境温度下进行传代培养。
超稀释利什曼原虫抗原的制备方法参考了Joshi等人的研究[14]，使用了敏感株和耐药株的利什曼原虫多诺万种的无菌前鞭毛体和前鞭毛体。寄生虫沉淀物的浓度为10
10个寄生虫/mL。
使用LDU和qPCR评估宿主组织中的利什曼原虫感染情况，可以全面评估寄生虫负荷和抗利什曼治疗的疗效。通过Giemsa染色肝组织涂片测量LDU，在接受udLA治疗的动物中，LDU显著降低（p < 0.0001），保护率为68.06%。同时观察到接受两性霉素B治疗的动物中的寄生虫负荷也显著下降。
利什曼原虫是一种专性细胞内寄生虫，主要存在于髓系细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞和单核细胞）中，随着疾病进展会对宿主免疫系统产生显著影响。寄生虫利用多种机制在宿主巨噬细胞内存活，使得治疗变得具有挑战性[22]。目前VL的治疗方案主要依赖于锑制剂（如葡萄糖酸锑胺和戊糖苷酸钠）等。
两性霉素B与超稀释利什曼原虫抗原的联合治疗为内脏利什曼病提供了一种具有疗效和安全性平衡的有前景的治疗策略。虽然两性霉素B在高剂量下表现出强大的抗利什曼活性，但其使用受到剂量依赖性肾毒性的限制。然而，当与udLA联合使用时，即使在较低剂量下，也能保持显著的疗效并显著降低毒性。
作者声明手稿中未使用人工智能生成的内容。
切特娜·班德拉尔（Chetna Bandral）：撰写初稿、方法学设计、实验实施、数据整理。
乔蒂·乔希（Jyoti Joshi）：撰写、审稿与编辑、监督、实验指导。
苏巴什·考希克（Subhash Kaushik）：项目管理、资金筹集、概念构思。
德巴达塔·奈亚克（Debadatta Nayak）：项目管理、资金筹集、概念构思。
苏克比尔·考尔（Sukhbir Kaur）：撰写、审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理、资金筹集、数据分析。
本研究由印度政府AYUSH部下属的中央顺势疗法研究委员会（Central Council for Research in Homoeopathy, CCRH）资助，项目编号为17–13/2022–23/CCRH/Tech/Coll/Panjab Univ-2022。
作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
作者感谢印度政府AYUSH部下属的中央顺势疗法研究委员会（CCRH）通过项目编号17-13/2022-23/CCRH/Tech/Coll/Panjab Univ-2022提供的财政支持，以完成本研究工作。
