两亲性的N端螺旋通过一种类似抗菌肽的机制，在进化过程中驱动由MLKL介导的坏死性凋亡（necroptosis）

《Developmental & Comparative Immunology》：Amphipathic N-terminal helices drive MLKL-mediated necroptosis through an antimicrobial peptide-like mechanism across evolution

MLKL介导的坏死机制及进化保守性研究表明，N端4HB结构在膜穿孔中起核心作用，其N端完整性对激活至关重要，而BR区域并非必需。人类与鲻鱼MLKL虽存在电荷分布和亲疏水特性差异，但均通过4HB的膜靶向和孔道形成实现膜破裂，且关键功能域的进化保守性支持跨物种功能传递。

　　

作者：田欣、金晓彤、姜帅

中国科学院海洋研究所海洋生物技术育种与可持续水产养殖国家重点实验室，中国青岛 266000

摘要

坏死性凋亡（Necroptosis）是一种高度调控的细胞死亡方式，由伪激酶MLKL执行。尽管N端的4HB结构域对MLKL介导的膜破坏至关重要，但该结构域在动物界中的保守性较低。MLKL如何靶向并破坏质膜，以及这些机制是否在进化过程中得以保留，目前仍不完全清楚。通过使用人类MLKL及其辐鳍鱼同源物，我们发现MLKL可以在不依赖于“brace”区域（一个促进MLKL寡聚化的结构域间连接器）的情况下被激活。实际上，只要N端的4HB结构域保持完整，就足以驱动膜破裂。逐步去除N端残基会导致细胞死亡，尽管寡聚化程度增加，这表明寡聚化是一个独立的过程，不足以单独实现膜溶解。进一步研究表明，静电电荷和疏水残基协同作用，促使MLKL发生构象变化，从而实现膜靶向、寡聚化和通透性改变；而破坏这两种特性中的任何一种都会显著降低细胞毒性。从机制上看，N端螺旋结构具有类似抗菌肽的理化特性，并在人类和鱼类的MLKL中均表现出直接的膜溶解活性。尽管不同物种间的电荷分布和两亲性特性存在差异，但MLKL介导的膜溶解机制在进化上是保守的。与此一致的是，人类和辐鳍鱼MLKL中的N端孔形成结构域和C端伪激酶结构域的功能性残基是保守的，前者发生突变会导致功能丧失，后者发生突变则可解除自我抑制并触发持续激活。这些发现共同揭示了控制MLKL介导的细胞死亡的分子决定因素，强调了其机制在进化过程中如何在保持核心功能的同时发生结构适应。

引言

程序性细胞死亡是维持免疫稳态和清除受损或感染细胞的基本过程（Fogarty和Bergmann，2017；Jorgensen等人，2017；Newton等人，2024）。与通过半胱天冬酶依赖性级联反应执行细胞死亡并维持质膜完整性的凋亡不同（Cohen等人，1992；Kari等人，2022），坏死性凋亡是一种严格调控的细胞死亡形式，在先天免疫调节中起着重要作用（Newton和Manning，2016；Wang等人，2014）。虽然病原体已经进化出复杂的策略来劫持凋亡机制，从而在细胞内存活并逃避免疫监视，但宿主细胞会通过触发灾难性的细胞溶解而发生坏死性凋亡（Nailwal和Chan，2019；Ucker，2016；Weinlich等人，2017）。通过摧毁受感染的细胞，宿主消除了病原体的复制环境，并将隐藏的病原体暴露给免疫细胞，从而促进清除（Zhang等人，2022）。因此，坏死性凋亡在免疫调节和宿主防御中扮演双重角色，虽然具有破坏性，但它能引发促炎反应（Bedoui等人，2020；Ye等人，2023；Yuan和Ofengeim，2024）。

坏死性凋亡的形态学特征是质膜的通透性增加，这会导致细胞内损伤相关分子（DAMPs）的无控制泄漏（Kaczmarek等人，2013；Kearney和Martin，2017）。DAMPs的释放会刺激免疫细胞并启动促炎免疫反应（Pasparakis和Vandenabeele，2015；Rucker等人，2024）。膜溶解的主要执行者是具有膜穿孔能力的混合谱系激酶结构域样蛋白MLKL（Murphy等人，2013）。结构上，MLKL由N端的四螺旋束（4HB）和C端的伪激酶结构域（CTD）组成，两者通过一个称为“brace”区域（BR）的多肽连接（Grootjans等人，2017）。在静息状态下，CTD对孔形成结构域4HB具有自我抑制作用，使蛋白质保持非活性构象（Garnish等人，2021；Murphy等人，2013）。当MLKL被磷酸化激活后，其伪激酶结构域发生构象变化，释放出4HB结构域，使其能够从细胞质转移到质膜（Hildebrand等人，2014；Zhao等人，2012）。活化的MLKL插入脂质双层并形成跨膜通道，从而破坏膜完整性（Samson等人，2020）。

MLKL的寡聚化是膜通透性的前提条件，因为单体MLKL会留在细胞质中，通常被认为无法破坏质膜（Cai等人，2014）。BR区域能够形成同型卷曲结构，促进MLKL组装成高度有序的跨膜通道（Davies等人，2018；Quarato等人，2016）。这种膜通透性导致离子流入和细胞渗透性膨胀，最终导致质膜破裂（Ros等人，2017）。尽管先前的研究强调了BR在MLKL介导的坏死性凋亡中的重要作用，但最近的证据表明存在不依赖BR的激活途径。例如，BR区域的错义突变可导致持续的、不依赖磷酸化的激活（Hildebrand等人，2020），而4HB结构域本身就足以诱导MLKL寡聚化和随后的膜溶解（Dondelinger等人，2014）。这些发现表明存在一种不需要BR的替代激活机制，尽管MLKL在缺乏BR的情况下如何执行细胞溶解的分子机制仍不清楚。

值得注意的是，坏死性凋亡机制在动物界中的保守性较低，甚至在不同物种之间也存在差异（Sethi等人，2022；Tanzer等人，2016）。例如，猪的MLKL异位表达可以在人类细胞中恢复坏死性凋亡信号；而马和猪的MLKL可以重组小鼠的坏死性凋亡途径（Davies等人，2020）。这些跨物种的差异表明，MLKL在构象转换方面经历了显著的结构分化，导致了物种特异性的激活机制（Lawlor等人，2024）。在本研究中，我们探索了人类MLKL的BR独立激活机制，并研究了这种机制在中国鳎鱼（一种辐鳍鱼）中的进化保守性。我们发现，删除人类和鳎鱼MLKL中的BR区域会降低其杀伤效率，但不会完全消除其诱导坏死性凋亡的能力。我们的研究进一步表明，N端螺旋结构的完整性，特别是其正电荷和两亲性特性，是膜溶解的关键决定因素。值得注意的是，鱼类MLKL的N端区域与其人类对应物在理化特性上存在差异，但仍保持相同的膜溶解功能。综上所述，这些发现表明，尽管MLKL的核心功能在进化上得到了保留，但不同物种之间发展出了不同的分子策略，以确保有效的细胞死亡和抗菌防御。

MLKL同源物的序列分析

MLKL序列是从国家生物技术信息中心参考序列数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/）中检索的。序列比对通过CLUSTALW程序（https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw）完成。蛋白质序列的保守性通过WebLogo工具可视化（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）。二级结构预测和疏水性分析使用ExPASy ProtScale工具进行（https://web.expasy.org/protscale/）。

MLKL介导的细胞死亡过程中BR区域并非必需

MLKL是所有脊椎动物中坏死性凋亡的末端效应因子（Dondelinger等人，2016）。从结构上看，人类（Homo sapiens，HsMLKL）和辐鳍鱼中国鳎鱼（Cynoglossus semilaevis，CsMLKL）的同源物具有典型的结构，包括N端的四螺旋束（4HB）和C端的伪激酶结构域（CTD），两者通过一个结构域间连接区域（BR）相连（图1A，B）。在HEK293T细胞中过表达全长HsMLKL会导致细胞死亡

讨论

MLKL的激活是坏死性凋亡的最后执行步骤，由C端伪激酶结构域的构象变化触发（Mace和Murphy，2021；Petrie等人，2018）。这种变化解除了自我抑制，使N端的孔形成结构域4HB能够寡聚化，从而使MLKL能够转移到质膜并破坏它（Petrie等人，2019）。先前的研究表明，BR区域对于传递激活信号至关重要

CRediT作者贡献声明

田欣：撰写——原始稿件、项目管理、方法学研究、实验设计。金晓彤：方法学研究、实验设计。姜帅：撰写——审稿与编辑、原始稿件撰写、数据可视化、实验监督、资金申请、概念构思

数据可用性

所有数据均包含在正文或补充材料中。未生成和存储任何原始数据集。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号32322085、42276115）、中国科学院海洋大科学研究中心的重点部署项目（编号COMS2020Q03）、中国科学院青年创新促进协会（2021204）以及山东省泰山学者计划（2021）的支持。