《Ecotoxicology and Environmental Safety》：High fluoride exposure disrupts gut microbiota and induces intestinal barrier damage via RhoA/ROCK-mediated cytoskeletal remodeling
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本研究针对过量氟化物暴露损伤肠道屏障但具体机制不明的问题，研究人员通过建立高氟小鼠模型，整合宏基因组、代谢组及分子生物学技术，揭示了高氟暴露通过扰乱肠道菌群平衡、激活RhoA/ROCK信号通路、诱导细胞骨架重塑及顶端连接复合体（AJC）蛋白（如ZO-1、Claudin-1）的异常定位与表达，最终导致回肠通透性增加的具体机制，并鉴定出Bifidobacterium sp. SO1和Schaalia turicensis两个与损伤表型及代谢物强相关的关键菌种，为理解环境毒素介导的肠损伤提供了新的宿主-微生物互作机制，具有重要的理论和潜在应用价值。
氟，一种在自然界中广泛分布的元素，适量摄入有益于骨骼和牙齿发育，但过量则成为严重的环境污染物。氟化物污染，无论是地质来源还是人为活动造成，已然成为一个全球性的环境挑战。中国是高氟威胁严重的国家之一，存在饮水型、饮茶型和燃煤型等多种地方性氟中毒。肠道是氟化物吸收的主要部位，超过60%的氟以F-形式在此被吸收，这也使其更易遭受高氟暴露的损伤。已有证据表明，高氟会破坏肠道屏障功能，而肠道屏障作为微生物-宿主界面和抗病原体/毒素防御的关键结构，其损伤与多器官功能障碍（如慢性肾病进展）密切相关。然而，高氟暴露究竟如何破坏这道“城墙”？它是否通过改变我们肠道内数以万亿计的“居民”——肠道菌群——来间接作恶？这其中的分子“开关”和信号通路又是什么？这些问题尚不明确。
为了解答这些疑问，来自四川农业大学动物医学院动物微生态研究所的王丹丹等研究人员在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上发表了一项研究。他们通过建立急性高氟小鼠模型，综合运用宏基因组学、代谢组学和分子生物学技术，深入探究了高氟诱导肠道屏障损伤的内在机制，并首次揭示了一条名为“肠道菌群-RhoA/ROCK-细胞骨架”的关键调控轴。
为了开展这项研究，作者主要运用了以下关键技术方法：他们通过灌胃氟化钠（NaF）建立了低剂量（12 mg/kg）和高剂量（24 mg/kg）的C57BL/6J小鼠暴露模型，处理周期为8周。研究技术体系涵盖了组织病理学（H.E.染色）和超微结构观察（透射电镜，TEM）以评估肠道形态和细胞连接变化；通过检测血清脂多糖（LPS）、D-乳酸（D-LA）和二胺氧化酶（DAO）水平评估肠道通透性；利用实时定量PCR（RT-qPCR）、免疫荧光和蛋白质印迹（Western Blot）技术检测了与细胞骨架（F-actin）、RhoA/ROCK信号通路（RhoA, ROCK1/2, MLCK, p-MLC）以及顶端连接复合体蛋白（ZO-1， Claudin-1， β-catenin， Occludin）相关的基因和蛋白表达与定位。此外，通过对回肠内容物进行非靶向代谢组学分析和宏基因组鸟枪法测序，系统揭示了高氟暴露下肠道微生态和代谢谱的变化，并进一步通过相关性分析和网络分析筛选出与损伤表型关联密切的关键菌种和代谢物。
研究结果部分揭示了以下发现：
3.1. 高氟暴露导致肠道通透性改变
研究显示，高氟暴露显著增加了小鼠血清中的LPS、DAO和D-LA水平，同时降低了回肠组织的总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，并提高了过氧化氢（H2O2）含量。组织学观察发现，高氟组小鼠回肠绒毛排列紊乱，隐窝加深，绒毛长度/隐窝深度比值显著降低，表明肠道结构和抗氧化防御系统受损，通透性增加。
3.2. 高氟暴露对肠道紧密连接的影响
高氟暴露破坏了回肠上皮细胞间顶端连接复合体（AJC）的完整性。尽管ZO-1的mRNA水平上调，但其蛋白质表达和膜定位均显著下降，并出现胞质内化现象。Claudin-1的蛋白表达也下降。虽然Occludin的总蛋白量无显著变化，但其膜定位连续性被破坏，出现断裂和紊乱。此外，黏附连接蛋白β-catenin的表达上调，但同样从细胞膜移位至胞质。透射电镜观察证实，高氟处理后紧密连接（TJ）和黏附连接（AJ）区域的电子致密结构扩张并深入胞质。
3.3. 高氟暴露对细胞骨架的影响
作为细胞结构和连接锚定的基础，细胞骨架蛋白F-actin在高氟暴露后发生显著重构。其mRNA和蛋白表达均上调。免疫荧光和共聚焦显微镜观察发现，正常组中F-actin沿细胞膜连续分布，而氟暴露组中其连续性被破坏，顶端的肌动蛋白网络扩张，纤维发生重排。透射电镜也观察到氟暴露组肠上皮细胞形态发生拉长和压扁的变化。
3.4. 高氟暴露对RhoA/ROCK信号通路的影响
机制探究发现，高氟暴露特异性激活了RhoA/ROCK信号通路，而非Rac1。高氟组小鼠回肠组织中RhoA、ROCK1、ROCK2的mRNA和蛋白水平均显著升高。尽管MLCK的mRNA水平升高，但其蛋白水平却下降。与此同时，其下游效应分子磷酸化肌球蛋白轻链（p-MLC）的蛋白水平显著增加。这表明高氟通过激活RhoA/ROCK，促进了p-MLC的增加，从而驱动了F-actin应激纤维的形成和收缩。
3.5. 高氟暴露对小鼠回肠内容物微生物群落结构的影响
宏基因组学分析表明，高氟暴露改变了回肠菌群结构。虽然在Alpha多样性指数上无显著差异，但主坐标分析（PCoA）显示对照组（C）、低氟组（FL）和高氟组（FH）的菌群构成形成独立簇群。在门水平上，Verrucomicrobia（疣微菌门）和Actinobacteria（放线菌门）等丰度发生显著变化。在属和种水平上，Lactobacillus（乳杆菌属）、Akkermansia（阿克曼菌属）、Lactobacillus johnsonii和Akkermansia muciniphila等菌的相对丰度发生显著改变。LEfSe分析鉴定出各组特有的标志性物种。
3.6. 高氟暴露对小鼠回肠内容物代谢物的影响
代谢组学分析显示，高氟暴露显著改变了回肠的代谢谱。差异代谢物主要富集在亚油酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成、鞘脂代谢、鞘脂信号通路和神经活性配体-受体相互作用等通路。其中，9-HODE、9-KODE、13-KODE、亚麻酸、亚油酸、γ-亚麻酸等代谢物在氟暴露组中上调，而棕榈酸、鞘氨醇、植物鞘氨醇、血小板活化因子等代谢物则下调。这些代谢物变化可能与RhoA/ROCK通路的激活及细胞骨架重塑密切相关。
3.7. 关键OTU的鉴定及其与细胞骨架相关代谢物的关联分析
通过特异性-占据率（SPEC-OCCU）分析和相关性网络构建，研究人员筛选出在高氟暴露下具有高特异性和高占据率的关键菌种：Bifidobacterium sp. SO1和Schaalia turicensis。相关性分析进一步证实，这两个关键菌种与肠道通透性指标（DAO、D-LA、LPS）、氧化应激指标（T-AOC、GSH、H2O2）、细胞骨架蛋白F-actin、RhoA/ROCK通路分子以及紧密连接蛋白（ZO-1, β-catenin）均呈现出强相关性。同时，它们也与前述关键的细胞骨架相关代谢物（如鞘氨醇）的变化显著相关。
综合研究结果与讨论，本研究的结论清晰而有力：高氟暴露破坏了肠道菌群稳态，这种菌群紊乱通过代谢物等途径，激活了肠上皮细胞内的RhoA/ROCK信号通路。被激活的ROCK通过增加p-MLC的水平，驱动了细胞骨架核心蛋白F-actin的重排和聚合。紊乱的细胞骨架无法有效锚定和维持顶端连接复合体（AJC）蛋白（如ZO-1、Claudin-1、Occludin）在细胞膜上的正确定位与表达，导致这些蛋白内吞入胞质，连接结构解体，最终致使回肠上皮屏障通透性增加。研究首次将肠道菌群紊乱、RhoA/ROCK通路激活、细胞骨架重塑和肠道屏障损伤这四个环节串联起来，提出了“肠道菌群-RhoA/ROCK-细胞骨架”轴是氟化物诱导肠屏障功能障碍的核心机制。
这一发现具有重要意义：首先，它从宿主-微生物互作的新视角，阐明了环境污染物氟化物损害肠道健康的一种全新机制，超越了以往单纯从宿主细胞角度出发的研究范式。其次，研究鉴定出的Bifidobacterium sp. SO1和Schaalia turicensis等关键菌种，以及鞘氨醇等关键代谢物，为开发基于益生菌、益生元或代谢物干预的精准营养策略或治疗手段，以预防或修复氟暴露导致的肠道损伤，提供了潜在靶点和理论依据。最后，该研究揭示的RhoA/ROCK-细胞骨架通路，也可能为其他环境毒素或致病因素引起的肠道屏障损伤研究提供共性机制参考。
