《European Journal of Medicinal Chemistry》：Steroidal hormones and neurosteroids - novel therapeutic strategies in bacterial infections: Design, synthesis, and biological evaluation
编辑推荐：
抗多重耐药金黄色葡萄球菌甾体激素衍生物抑制外排泵的机制研究。通过荧光法及药敏试验评估26种内源性/合成甾体激素对ciprofloxacin/erythromycin增效作用，发现13、16号化合物通过C-3极性取代和C-17非极性取代显著抑制外排泵，降低MIC值2-4倍，且无毒性或内分泌干扰。结构活性关系显示C-3/C-17取代是关键，转录组学证实化合物13可下调毒力基因表达。
Brdová Daniela | K?í?kovská Bára | ?pa?ek Jan | Míchal Zdeněk | Jablonská Eva | Strnad Ond?ej | Chodounská Hana | Szánti-Pintér Eszter | Morozovová Marina | Han?l Václav | Tkadlec Jan | Riool Martijn | Lipov Jan | Viktorová Jitka | Kudová Eva
布拉格化学技术大学生物化学与微生物学系，Technická 5，CZ 166 28 布拉格，捷克共和国
摘要
全球抗生素耐药性的上升迫切需要针对传染性疾病的新治疗策略。抑制细菌外排泵（这些泵促进了多重耐药性）是一种有前景的方法，可以恢复甚至提高现有抗生素的效力。通过基于荧光的溴化乙锭积累实验、肉汤稀释实验和棋盘实验，我们评估了26种内源性类固醇激素和神经类固醇以及30种合成衍生物，以确定它们是否能增强多重耐药金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）对抗生素的敏感性。结构-活性关系分析确定了化合物13和16作为候选药物，因为它们具有强烈的外排泵抑制作用，并显著降低了环丙沙星和红霉素的最低抑制浓度。这两种化合物在棋盘实验中表现出叠加效应。C-3位点的极性取代和C-17位点的3α,5β立体化学及非极性取代对于实现强效的外排抑制和敏感性至关重要，然而这些修饰联合使用时并没有叠加效果。转录组分析进一步显示，化合物13单独使用或与抗生素联合使用时，能够显著下调S. aureus的毒力相关基因。在人类外周血单核细胞中的细胞毒性评估以及雌激素、雄激素和孕激素受体的激活实验表明，最活跃的衍生物无毒且没有可检测到的内分泌活性，这表明其具有良好的安全性。总体而言，这些发现支持这样的观点：合理设计的基于类固醇的骨架可以作为竞争性细菌外排泵抑制剂，并作为潜在的抗生素辅助剂来缓解由外排作用介导的耐药性。
引言
类固醇激素是一类从胆固醇衍生的生物活性分子，在人体中发挥关键的调节作用[1]。这些亲脂性化合物主要在肾上腺、性腺和中枢神经系统中通过一系列酶促反应合成[2]。类固醇激素通过与细胞核受体结合发挥基因组效应，这些受体作为配体激活的转录因子来调节靶细胞内的基因表达，从而导致蛋白质合成和细胞功能的长期变化，例如代谢或生长改变。类固醇生成的复杂生化途径涉及多种生理相关的分子，如图1所示。根据其结构特征和生理功能，类固醇激素通常被分为四大类：孕激素、雄激素、雌激素和皮质类固醇（包括糖皮质激素和盐皮质激素）。另一类独特的类固醇是神经类固醇[4]，它们是大脑和神经系统中从胆固醇或循环中的类固醇前体合成的内源性化合物。神经类固醇及其合成类似物（神经活性类固醇）通过与神经递质受体（如γ-氨基丁酸A (GABAA)、N-甲基-D-天冬氨酸 (NMDA) 或 G蛋白偶联受体）相互作用，迅速调节神经元兴奋性。由于神经类固醇不作用于核受体，因此其作用机制被定义为非基因组的。
"类固醇激素和神经类固醇"的分类不仅反映了它们的化学结构，还反映了它们多样的生物活性，从调节免疫反应和代谢稳态到调控神经生物学过程[5]。类固醇激素的生理浓度范围很广，从皮摩尔水平的雌激素和孕激素[6]到纳摩尔水平的皮质类固醇（如皮质醇[7]）。某些激素，包括脱氢表雄酮 (DHEA) 和睾酮，在特定组织中可以达到微摩尔浓度[8]。值得注意的是，类固醇激素和神经类固醇在怀孕期间其浓度和生理作用会发生显著变化[9]、[10]、[11]。在病理条件下，激素水平可能会发生显著改变；例如，在库欣综合征[12]、严重应激或败血症[13]中，皮质醇水平可能超过微摩尔浓度，而在各种内分泌疾病中，雌激素、DHEA 或睾酮的水平也可能升高或降低[14]，这突显了它们在广泛浓度范围内的强大生物学效应。
最近，人们开始关注类固醇的潜在治疗价值，不仅在神经学和精神病学领域，还在于调节免疫功能和对抗传染病的敏感性[15]。许多研究表明，微生物能够响应宿主信号分子，包括类固醇激素。这些激素以复杂的方式与细菌相互作用，影响细菌的各种行为，包括生长、抗菌敏感性、代谢、应激反应、群体感应和毒力[16]、[17]、[18]、[19]。此外，最近的研究强调了类固醇在个性化医学中的作用，认为性别和激素状态是治疗策略中的关键因素。研究表明，性类固醇激素以性别特异性的方式影响细菌-宿主相互作用和感染敏感性[20]、[21]。此外，还有研究表明，雄激素和糖皮质激素会影响微生物的生长和抗生素敏感性，这突显了类固醇激素在微生物行为和抗菌敏感性中的重要性[22]。
细菌对抗生素的耐药性是现代医学中的一个主要问题，而细菌耐药性的一个基本机制是过度产生外排泵，这些泵将抗生素主动从细胞内运输到细胞外，从而将其细胞内浓度降低到治疗阈值以下，使抗生素的效果减弱[23]。外排泵对细菌生存至关重要，因为它们有助于清除有毒化合物，包括内源性代谢物和外来物质（如抗生素）。
人类细胞也利用外排泵来维持激素平衡和细胞稳态，这些泵对于内源性类固醇激素跨生物膜的主动运输至关重要。这种运输不仅对于清除细胞内的多余类固醇至关重要，而且对于在组织间形成激素梯度、控制局部激素可用性以及在受体激活后终止激素信号传导也必不可少。几种已知的人类外排泵，特别是来自ATP结合盒 (ABC) 转运蛋白家族的泵，如P-糖蛋白 (MDR1/ABCB1)、乳腺癌耐药蛋白 (BCRP/ABCG2) 和多重耐药 (MDR) 相关蛋白，已知能够介导类固醇激素及其代谢物的外排[24]。
有趣的是，其中一些人类转运蛋白与细菌外排泵在结构和功能上具有相似性，例如来自耐药-调节-分裂 (RND) 和 ABC 家族的泵。这种相似性提出了一个有趣的可能性，即细菌外排系统也可能与类固醇分子相互作用，类固醇分子也可能成为细菌外排系统的底物[25]、[26]。例如金黄色葡萄球菌等细菌会通过增加外排泵的产生来适应环境压力，包括对抗生素的暴露，从而主动排出抗菌剂。一个典型的例子是NorA外排泵，它属于主要促进剂超家族 (MFS)，有助于细菌抵抗多种化合物，包括氟喹诺酮类[23]。
鉴于人类类固醇激素是多种人类外排泵的底物，可以推测结构相似的分子也可能与细菌外排系统相互作用。在这种情况下，类固醇激素可以作为细菌外排泵的竞争性抑制剂，与转运蛋白结合并有效竞争抗生素的输出。这种相互作用可以减少抗生素的外排，从而增加其在细胞内的浓度，可能增强抗菌效果。本研究的目的是进一步验证这一假设，并评估内源性类固醇的结构修饰是否能够产生更有效的细菌外排泵抑制剂。如果成功，这种策略可能代表一种新的辅助疗法。
一般信息
所有商业试剂和溶剂均未经进一步纯化使用。熔点是通过微熔点仪（Helmut Hund，德国）测定的，未经校正。元素分析使用的是PE 2400 Series II CHNS/O 分析仪（PerkinElmer，美国马萨诸塞州），微天平为MX5（Mettler Toledo，瑞士）。光学旋转在AUTOPOL IV偏振仪（Rudolph Research Analytical，美国新泽西州）上进行测量；所有样品均在20°C下进行测量。
图1中显示的类固醇组合与五种具有不同作用机制的临床相关抗生素进行了测试：苯唑西林、庆大霉素、四环素、环丙沙星和红霉素。已知这些抗生素是通过外排泵从细胞中排出的，最常见的外排泵属于主要促进剂超家族（MFS；例如 LmrS [51]；tetA, tet38 [52]；NorA, NorB, NorC [53]）和 ATP结合盒 (ABC) 家族（例如 AbcA [51]；MsrA [51]）。
本研究的目的是验证内源性类固醇激素、神经类固醇及其合成类似物能够影响细菌外排泵的活性，从而提高抗生素效力的假设。为了评估它们的活性，进行了两项互补的实验：一种用于直接测量外排的EtBr积累实验，以及一种用于功能性最低抑菌浓度 (MIC) 降低的抗生素敏感性实验（使用环丙沙星或红霉素）。
本研究得到了捷克共和国技术局、国家个性化医学能力中心（从转化研究到生物医学应用项目 TN02000109）以及国家病毒学和细菌学研究所（EXCELES 计划，项目编号 LX22NPO5103）的支持——该项目由欧盟下一代欧盟计划资助。本研究还得到了捷克科学院（RVO 61388963）和捷克卫生部的支持。
?pa?ek Jan：可视化、软件、方法学、研究、数据管理。K?í?kovská Bára：写作——审稿与编辑、方法学、研究。Lipov Jan：写作——审稿与编辑、研究。Brdová Daniela：写作——审稿与编辑、初稿撰写、方法学、研究、数据分析。Riool Martijn：写作——审稿与编辑、方法学。Chodounská Hana：研究。Strnad Ond?ej：写作——审稿与编辑、方法学、研究。
支持本文结论的原始数据将由作者根据请求提供。
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
在准备这项工作时，作者（EK, DB）使用了ChatGPT来提高手稿的语言质量，因为他们不是英语母语者。使用该工具/服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物的内容负全责。
? 作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的利益冲突：Eva Kudova 和 Jitka Viktorova 表示获得了捷克共和国技术局的财务支持。Jan Tkadlec 表示获得了捷克卫生部的财务支持。Jitka Viktorova 表示获得了捷克教育、青年和体育部的资助（用于Talking Microbes项目）。Vaclav
