红葡萄酒陈酿过程中缩合单宁氧化转化途径的特征分析：来自伪靶向代谢组学的见解

《Food Chemistry》：Characterization of condensed tannin oxidative transformation pathways during red wine ageing: Insights from pseudo-targeted metabolomics

本研究通过伪靶向代谢组学结合mentofuran解聚技术，首次同时鉴定了葡萄酒陈酿中邻苯二酚和乙醛介导的30种单宁氧化亚单元，揭示了橡木桶陈酿与加速陈化技术（AATs）在单宁结构演化上的差异，量化显示邻苯二酚氧化亚单元占比显著更高（7-9倍），并解析了其氧化位点及稳定性差异，为单宁陈化机制研究提供新方法。

　　

黄永策|崔东升|张一鸣|于柯基|史颖|段长青|齐梦瑶|兰一斌

中国农业大学食品科学与营养工程学院葡萄与葡萄酒学中心，北京100083

摘要

缩合单宁通过醌和乙醛途径的氧化在葡萄酒陈酿过程中对涩味的形成起着关键作用，但它们各自的贡献仍不清楚。我们开发了一种伪靶向代谢组学方法，并优化了薄荷呋喃解聚方法，鉴定出了30种氧化亚单位，包括新的没食子酸酯化和三羟基化形式。首次同时分析了在橡木桶陈酿和不同加速陈酿测试（AATs）过程中醌和乙醛介导的氧化亚单位以及缩合单宁的天然形式。橡木桶陈酿显著减少了天然单宁并增加了氧化单宁——这种变化在加速陈酿测试中并未出现。从数量上看，醌氧化单宁是主要的氧化形式，其含量是乙醛衍生单宁的7-9倍。在结构上，醌氧化主要针对末端/延伸单元，而乙醛氧化单元则分布在自由型和延伸型中。易氧化的黄烷醇类化合物最为敏感，而三羟基化形式则表现出更高的稳定性。这项工作为阐明葡萄酒陈酿过程中单宁的转化提供了基础框架。

引言

人们普遍认为缩合单宁在干红葡萄酒的涩味形成中起着重要作用。它们的浓度和结构特征（包括黄烷醇间的连接模式、聚合度、没食子酸酯化程度和三羟基化水平）显著影响涩味的强度、特征和整体质量（Huang & Xu, 2021）。在浸渍、发酵和陈酿过程中，氧气的作用会引发一系列化学反应，改变缩合单宁的结构并生成氧化单宁，从而调节葡萄酒的涩味特性（Cui et al., 2025）。

葡萄酒的氧化可以分为酶促和非酶促类型。酶促氧化主要发生在葡萄汁中，由儿茶酚氧化酶和漆酶介导；而非酶促氧化则由于乙醇含量的增加而在葡萄酒中占主导地位，这导致酶活性降低（Li & Duan, 2019; Zhao et al., 2023）。在金属离子介导的氧气消耗和过氧化氢（H₂O₂）生成过程中，会生成Fe³⁺和羟基自由基（HOO•）等活性中间体（图S1）。这些中间体会氧化黄烷醇和缩合单宁，最初生成半醌和醌自由基，随后进一步转化为醌（Zhao et al., 2023）。生成的醌结合黄烷醇或缩合单宁单元的氧化还原电位低于其酚类前体，使其更容易与其他黄烷醇或未氧化的黄烷醇发生反应，形成醌氧化单宁（Li & Duan, 2019）。这一过程涉及新的黄烷醇键的形成或分子内重排，最终导致单宁聚合（Mouls & Fulcrand, 2012）。此外，H₂O₂在Fe²⁺的催化下发生芬顿反应，生成高活性的非选择性羟基自由基（HO•），后者可将乙醇氧化为乙醛（Elias & Waterhouse, 2010）。在葡萄酒的酸性环境中，乙醛以碳正离子的形式存在，能够与黄烷醇单元的C8或C6位发生亲核反应，进而生成乙醛衍生单宁（Cucciniello et al., 2023; Rivas-Gonzalo et al., 2002）。据推测，在橡木桶陈酿过程中，这种氧化结构变化会使单宁的风味从最初的粗糙变得圆润柔和。因此，精确表征这些氧化单宁的组成和含量对于阐明葡萄酒涩味改善和调节的内在机制至关重要。

然而，缩合单宁及其氧化衍生物具有复杂的结构特征和高分子量，这使得通过色谱技术直接分离和质谱检测变得困难（Mouls et al., 2011）。因此，目前的研究通常采用化学解聚策略来分析其亚单位的组成，尽管某些单体和寡聚体（如二聚体和三聚体）可以直接检测到（Liu et al., 2021）。亲核试剂在酸性条件下可以断裂天然的B型黄烷醇间连接（IFL），但无法断裂氧化反应形成的共价键（图1A）。因此，氧化结构主要以寡聚体形式释放，而天然结构则以单体形式释放。在C4位引入亲核试剂可以区分延伸单元和末端单元（Mouls & Fulcrand, 2015）。

许多研究使用质谱和核磁共振等技术来表征通过化学解聚释放的氧化亚单位（氧化标记物）的结构特征。已经确定了四种类型的醌氧化亚单位的黄烷醇间连接方式（图1B）：(i) β-型，由A环和B环之间的单个CC键形成；(ii) ε-型，由A环和B环之间的醚键连接；(iii) γ-型，包含一个醚键、一个CC键、一个来自C环到B环的黄烷醇内醚键，以及一个黄烷醇单元内的羰基；(iv) δ-型，由一个醚键、一个C-C双键以及两个亚单元的羰基组成（de Sousa Dias et al., 2022; Verloop et al., 2016）。关于葡萄酒中的乙醛介导的反应，已经进行了大量研究，探讨了黄烷醇/单宁和花青素聚合产物的形成机制及其对颜色的影响（Liu et al., 2019; Teng et al., 2019）。到目前为止，已经鉴定出四种主要的乙醛衍生亚单位（图1B）。乙醛首先通过亲核攻击黄烷醇的C6或C8位形成乙基桥接的二聚体（Es-Safi et al., 1999; Fulcrand et al., 1996）。随后这些乙基桥接二聚体的断裂和还原反应生成乙基和乙烯基黄烷醇单体（Cruz et al., 2009; Cucciniello et al., 2023）。此外，乙烯基黄烷醇单体的聚合可以通过新吡喃环的组装形成乙烯基桥接的二聚体（Cruz et al., 2009）。因此，醌和乙醛途径作为竞争性驱动力，使缩合单宁向不同的分子结构发展。无论以自由形式存在还是作为聚合物中的末端或延伸单元整合，这些氧化亚单位都会为单宁基质引入不同的空间和化学性质。这种结构差异意味着这两种途径之间的相互作用和平衡是决定最终葡萄酒涩味特性的关键因素。

为了阐明缩合单宁氧化单元的结构异质性，先前的研究采用了质量缺陷过滤和分子网络分析结合高分辨率质谱的非靶向代谢组学方法（Razafindrabenja et al., 2025; Vallverdú-Queralt et al., 2017）。然而，尽管对氧化反应已有深入了解，醌与乙醛途径对缩合单宁结构演变的精确贡献仍存在争议。这种不确定性主要是由于分析限制：尚未有研究同时量化醌氧化和乙醛衍生的亚单位，而且不同研究中使用的亲核试剂不同，阻碍了直接比较分析（Mouls & Fulcrand, 2012; Teng et al., 2021; Vallverdú-Queralt et al., 2017）。此外，大多数研究主要集中在儿茶素或表儿茶素类型的氧化单元上（Deshaies, Garcia, et al., 2022; Vallverdú-Queralt et al., 2017），而对没食子酸酯化和三羟基化形式的关注较少（Mouls & Fulcrand, 2015; Tan et al., 2020; Tan et al., 2023）。因此，关于每种途径对特定反应位点（自由、末端或延伸单元）的偏好、对不同黄烷醇亚单位的选择性以及它们对整体葡萄酒单宁组成的相对定量贡献等关键机制方面仍不清楚。尽管加速陈酿技术已被证明有助于模拟颜色和花青素的演变（Garcia et al., 2023; Garcia et al., 2025），但它们是否能够再现真实橡木桶陈酿对缩合单宁及其氧化衍生物的影响尚未得到证实。

为了揭示氧化单宁复杂的结构演变并解决葡萄酒陈酿过程中醌和乙醛途径之间的竞争，本研究建立了一种基于伪靶向代谢组学策略的新分析框架（Yang et al., 2025）。该综合工作流程经过精心设计，通过三个连续步骤克服了现有的分析限制：(1) 根据已知的醌和乙醛途径的反应产物，构建氧化单体和二聚体的理论质谱库，然后进行化学合成并开发靶向质谱检测方法；(2) 基于氧化末端单元的产率比较四种亲核试剂的解聚效率，选择最有效的试剂，从而能够进行氧化延伸单元的计算机预测；(3) 实验鉴定这些延伸单元，最终确定氧化亚单位的全面定量方法。最后，将验证的方法应用于研究真实橡木桶陈酿和不同加速陈酿技术对葡萄酒中氧化单宁组成的影响。

化学试剂

甲醇和乙腈（>99.99%）购自Honeywell（美国新泽西州Morristown）。乙醇（>99.9%）和甲酸（>99%）购自Roe Scientific Inc.（美国新泽西州Newark）。超纯水来自Milli-Q水纯化系统（Millipore，美国马萨诸塞州Bedford）。（?)-表儿茶素（≥98%），（+）-儿茶素（≥98%），（?)-表儿茶素-3-O-没食子酸酯（≥98%），（?)-表没食子素（≥98%），（+)-表没食子素-3-O-没食子酸酯（≥98%），原花青素B2（97%）

缩合单宁氧化单体和二聚体的合成

根据以往的研究（de Sousa Dias et al., 2022; Verloop et al., 2016），醌氧化亚单元中的β-型和ε-型结构是分子量相同的异构体。它们的结构差异在于连接A环和B环的键类型——要么是CC键，要么是醚键。然而，由于质谱中的碎片化位点不涉及这些特定键，这两种异构体产生的特征碎片离子几乎相同。

结论

通过伪靶向代谢组学分析、氧化产物的合成、亲核试剂的评估和反应条件的优化，我们建立了一种基于薄荷呋喃解聚与UHPLC-QqQ-MS/MS定量的缩合单宁氧化亚单位的分析方法。共鉴定出30种氧化亚单位：15种为自由或末端单元（单体/二聚体），其中一半包括13种没食子酸酯化的单元

CRediT作者贡献声明

黄永策：撰写——初稿，可视化，方法学，形式分析，概念化。崔东升：撰写——审阅与编辑。张一鸣：撰写——审阅与编辑。于柯基：撰写——审阅与编辑，监督，资源获取，资金筹集，概念化。史颖：撰写——审阅与编辑，监督，项目管理。段长青：撰写——审阅与编辑，监督，资源获取，项目管理，资金筹集，概念化。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：32402166）、宁夏回族自治区研发计划重点项目（项目编号：2022BBF01003）、国家外国专家个人项目（项目编号：H20240525）以及中国农业研究系统专项基金（项目编号：CARS-29）的支持。