《Food Chemistry: X》：Multi-omics analysis of functional component networks in human, porcine, and ruminant milk: Insights for precise design of infant formula and milk replacers based on bovine milk
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为解决婴幼儿配方奶粉（IF）及幼畜代乳品（MR）在免疫调节和神经发育功能上与母乳存在显著差距的问题，研究人员通过整合代谢组学、脂质组学和蛋白质组学技术，系统比较了牛、山羊、绵羊、猪及人乳汁的分子组成。研究发现，猪乳富含神经发育相关的极性磷脂和长链多不饱和脂肪酸（如DHA），而人乳则以其独特的寡糖和免疫调节小分子微环境为特征。反刍动物乳则含有高水平的特定功能蛋白（如黄嘌呤脱氢酶、骨桥蛋白）和活性代谢物（如尿囊素）。该研究为基于牛乳精准设计下一代婴儿配方奶粉和动物代乳品提供了分子层面的科学依据。
母乳，被公认为哺乳动物后代最理想的营养来源，其成分复杂而精妙，富含蛋白质、脂质和代谢物，对婴儿的生长发育、免疫调节和健康维持起着至关重要的作用。然而，全球母乳供应短缺的现实，使得以牛乳为基础的婴儿配方奶粉（IF）成为了婴幼儿营养的重要替代品。同时，在现代畜牧业中，对羔羊、犊牛和仔猪等幼畜进行早期断奶并饲喂代乳品（MR）已成为常见做法。但问题也随之而来：婴幼儿食用配方奶后，牛奶过敏（CMA）仍是一个普遍问题，部分原因是牛乳中α-S1-酪蛋白的存在。尽管深度水解配方粉的出现让过敏婴儿也能安全食用牛乳制品，但母乳喂养与配方奶喂养的婴儿之间仍存在显著的免疫差异，后者表现出Th2偏向和免疫细胞过度活化的迹象。同样，与饲喂自然乳汁的羔羊相比，饲喂传统MR的羔羊通常表现出更低的营养消化率、饲料效率、日增重以及更高的腹泻发生率，这可能与MR喂养导致的肠道抗氧化能力受损和微生物群发育不良有关。这一切都指向一个核心问题：现有的IF和MR配方，在功能成分上距离母乳或特定物种的自然乳汁还有多大差距？如何通过科学设计来弥补这些差距？
为了回答这些问题，并深入探索不同物种乳汁在支持后代健康方面的独特“配方”，来自沈阳农业大学的一支研究团队在《Food Chemistry: X》上发表了一项研究。他们采用了一种前沿的系统生物学方法——整合多组学分析，对牛（Holstein bovine, HST）、绵羊（Small Tail Han ovine, OAS）、山羊（Liaoning Cashmere caprine, LCG）、人（Chinese human, CHP）和猪（Large White porcine, YXP）这五种哺乳动物的成熟乳进行了全面的“成分普查”。研究旨在揭示这些乳汁在代谢物、脂质和蛋白质层面的精细差异，并构建它们之间的功能成分网络，从而为基于牛乳精准设计下一代IF和MR提供全新的科学蓝图。
为了开展这项研究，研究人员主要运用了三大关键技术：基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF MS）的非靶向代谢组学、基于超高效液相色谱-轨道阱质谱（UPLC-orbitrap-MS）的脂质组学，以及4D非标记定量蛋白质组学。他们收集了产后两周的健康个体乳汁样本，每种乳汁类型设置多个生物学重复，通过这三大技术平台，系统性地描绘了五种乳汁的分子图谱。随后，利用多元统计分析方法（如主成分分析PCA、正交偏最小二乘判别分析OPLS-DA）筛选差异分子，并通过相关性分析、网络互作分析（使用Cytoscape软件）以及KEGG通路富集分析，深入挖掘不同物种乳汁中功能成分的关联与潜在生物学意义。
3. 结果
3.1. 代谢组学揭示与免疫相关的分子
代谢组学分析共鉴定出1498个显著差异的代谢物。分析发现，与其他物种相比，牛乳（HST）中下调的代谢物数量更多，初步提示其他物种的乳汁可能含有更丰富的潜在功能成分。功能富集分析表明，差异代谢物显著富集在ABC转运体和氨基酸生物合成等通路中。值得注意的是，聚类和相关性分析揭示了物种特异的代谢物关联模式。例如，在猪乳（YXP）中含量丰富的磷酸吡哆醛和N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac），与人乳（CHP）中高表达的乳糖-N-新四糖（Lnnt）呈高度正相关。此外，刺囊酸（EA）和尿囊素在反刍动物乳（如HST和OAS）中丰度显著较高且呈现明确的聚类趋势。网络分析进一步发现，在人乳和猪乳中富集的亚油酸与尿囊素（在反刍动物乳中富集）呈显著负相关。同时，丙丁酚特异性地富集于人乳，牛磺酸在山羊乳（LCG）中高度富集，而重要的唾液酸化人乳寡糖（HMO）3′-唾液酸乳糖（3′-SL）在猪乳中含量较高。这些物种特异的代谢物关联模式共同构成了潜在的免疫调节微环境基础。
3.2. 生物活性脂质信号分子的物种特异性差异
脂质组学分析揭示了不同物种乳汁中生物活性脂质信号分子组成的显著差异。研究发现，反刍动物乳的总脂质含量高于人乳和猪乳，其中超过90%的脂质是甘油脂（GL），尤其是甘油三酯（TG）。然而，反刍动物乳中甘油磷脂（GP）的含量远低于猪乳（63.419%）和人乳（19.466%）。猪乳富含极性磷脂，如磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甘油（PG）和磷脂酰胆碱（PC），这些是细胞膜的核心成分和重要的信号前体。在关键的生物活性脂质中，对神经发育和免疫调节至关重要的n-3和n-6系列多不饱和脂肪酸（PUFA）显示出显著的物种特异性分布。猪乳和人乳在脂肪酸组成上具有明显优势：二十二碳六烯酸（DHA）、二十碳五烯酸（EPA）、亚油酸（LA）和花生四烯酸（AA）的相对丰度在猪乳中显著高于其他物种；同样，人乳中的DHA和AA丰度也显著高于反刍动物乳。差异比较火山图分析进一步证实了物种间独特的脂质谱。相关性及网络分析揭示了脂质信号传导中潜在的协同与拮抗关系，例如PC(18:1_20:4)与几乎所有被测脂质均呈强正相关，暗示其可能在脂质代谢网络中占据中心节点位置。
3.3. 蛋白质组学揭示免疫蛋白谱
蛋白质组学分析显示，不同物种乳汁中鉴定出的蛋白质数量各异，其中人乳（CHP）鉴定出的蛋白质总数最高（1193个），而猪乳（YXP）最少（478个）。牛乳（HST）与绵羊乳（OAS）的蛋白数量相近。定量蛋白质组学分析发现，黄嘌呤脱氢酶（XDH）、乳凝集素和骨桥蛋白（OPN）主要在牛乳中富集。乳铁蛋白（LTF）、免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G（IgG）在猪乳中含量最高。脂蛋白脂肪酶（LPL）在人乳中最丰富。蛋白质-蛋白质相互作用网络分析显示，白蛋白（ALB）在网络中占据中心位置，并与其他蛋白质存在最广泛的相互作用。亚细胞定位分析表明，在所有分析的物种中，大多数蛋白质位于细胞外，这表明包括大多数免疫相关物质在内的功能分子主要在细胞外环境中发挥作用。
3.4. 整合功能分析
通过整合多组学数据，研究人员发现了不同物种乳汁中功能成分之间特定的相互作用模式。KEGG通路富集分析确定了与检测到的蛋白质和代谢物关联最强的前十条通路。神经活性配体-受体相互作用通路在牛乳、人乳和绵羊乳样本中共同富集；半乳糖代谢通路在山羊乳和猪乳样本中显著富集；此外，甘油脂代谢通路在牛乳样本中显示富集。相关性层次聚类热图和相关性热图展示了关键蛋白质、代谢物和脂质之间的关系。成对网络分析用于探究不同动物物种乳汁中代谢物、脂质和蛋白质之间的相互作用。例如，在牛乳中，磷脂酰丝氨酸PS(16:2e_22:6)与刺囊酸（EA）呈正相关，但与骨桥蛋白（OPN）和牛磺酸呈负相关。在绵羊乳中，乳铁蛋白（LTF）与尿囊素呈正相关。在山羊乳中，LTF与PE(18:3e_22:5)呈正相关。在人乳中，脂蛋白脂肪酶（LPL）与EA呈正相关，并且与DG(36:2e)呈高度显著相关。在猪乳中，乳糖-N-新四糖（Lnnt）与TG(6:0_6:0_18:3)呈高度显著正相关。
4. 讨论与结论
本研究聚焦于分析不同物种成熟乳的功能成分谱，并基于牛成熟乳开发IF和MR。需要指出，成熟乳与初乳在成分和功能优先级上存在根本差异，成熟乳通常富含与长期营养供给和特定生理调节相关的成分。本研究系统揭示了不同物种成熟乳在关键功能成分上的显著差异和独特优势，并深入探讨了这些成分形成的复杂功能网络及潜在机制。
研究发现，作为IF的关键成分，人乳寡糖乳糖-N-四糖（Lnt）和乳糖-N-新四糖（Lnnt）在人乳中含量最高，其次是猪乳。它们能抵抗胃酸降解，完整到达肠道发挥多种生理功能。Lnt可被微生物代谢为短链脂肪酸，为双歧杆菌和乳酸菌等有益菌创造竞争优势，同时可直接与病毒和真菌的相应受体结合，抑制其与肠上皮的粘附，并调节免疫细胞功能以维持肠道稳态。其岩藻糖基化衍生物Lnfp iii在人乳中丰度更高，能通过刺激Th2反应促进免疫系统成熟并调节肠道菌群。流行病学研究证实，母乳中较高浓度的Lnfp iii与婴儿较低的CMA风险相关。
唾液酸乳糖（SLs）是另一类重要的益生元化合物。猪乳被鉴定为3′-SL和6′-唾液酸乳糖（6′-SL）的丰富来源。在体内，SLs分解为神经氨酸（Neu5Ac）和乳糖。Neu5Ac可通过特定转运体进入双歧杆菌细胞，驱动其代谢途径，从而促进有益菌生长并抑制大肠杆菌和艰难梭菌等病原体的肠道粘附。此外，它们还能通过调节免疫细胞功能发挥抗炎作用。Neu5Ac是神经发育的关键物质。本研究发现Neu5Ac在猪乳、人乳和牛乳中含量丰富。研究表明，哺乳期补充6′-SL比单独补充Neu5Ac更能有效促进长期认知发展，表明完整的SL结构对神经发育具有独特价值。
脂质组成是乳汁功能差异的核心反映。在牛乳、绵羊乳和山羊乳中，甘油三酯（TG）和甘油二酯（DG）的相对丰度相似，甘油脂（GL）构成乳脂的90%以上。反刍动物乳中较高的TG水平主要归因于瘤胃微生物发酵产生的乙酸和丁酸直接促进TG生物合成。单甘酯（MG）在牛乳等反刍动物乳中也存在较高水平。关于磷脂，人乳中检测到的PC、PE和鞘磷脂（SM）含量可达牛乳的四倍。猪乳中极性磷脂（PL）的相对丰度显著高于其他乳汁样本，表明其在支持认知功能方面具有显著潜力。富含在乳脂肪球膜（MFGM）中的PL有助于改善婴儿的肠道屏障完整性和功能成熟度。
在脂质组成的差异分析中，猪乳表现出独特的脂质组谱，几种具有潜在生物学重要性的特定脂质分子含量显著高于其他乳汁样本。值得注意的是，含有超长链多不饱和脂肪酸（VLCPUFA）的脂质，如CerG2GNAc1 (d41:2)、Hex1Cer (t41:2)、Hex2Cer (m40:3)和PG (38:2)，在猪乳中特别富集。VLCPUFA是细胞膜构建、信号转导和内分泌调节的关键成分。关于n-3和n-6 PUFA，猪乳和人乳中的DHA含量显著高于牛乳、绵羊乳和山羊乳。DHA对大脑和视觉发育至关重要，并在调节神经炎症和神经递质活性中发挥作用。猪乳中的EPA比例也显著高于其他样本。EPA可以抑制促炎因子，促进大脑和视觉发育。AA在猪乳中含量最高，其次是人乳。AA是胎盘和神经细胞中的主要脂肪酸，支持婴儿的神经认知发育。n-3和n-6脂肪酸在代谢中共享关键酶，过高的膳食n-6脂肪酸会竞争性抑制n-3脂肪酸向EPA和DHA的转化。因此，猪乳和人乳中较高的DHA和EPA水平，结合其高AA含量，表明其脂肪酸谱更加平衡，可能更有利于神经发育。
定量蛋白质组学分析显示，黄嘌呤脱氢酶（XDH）、乳凝集素和骨桥蛋白（OPN）在牛乳中显著富集。XDH是脂滴形成和脂肪酸氧化的核心调节因子。乳凝集素通过促进巨噬细胞清除凋亡中性粒细胞，在肠道屏障修复、抗炎反应和抵抗轮状病毒感染中发挥重要作用。OPN在牛乳中水平最高，是一种糖基化磷蛋白，通过增强髓鞘形成过程，在婴儿神经行为发育中起关键调节作用。乳铁蛋白（LTF）在猪乳中含量最丰富，其含量在人乳中约为牛乳的四倍。LTF具有抗菌、抗癌和免疫调节活性。关于免疫球蛋白，虽然免疫球蛋白A是动物乳中最丰富的免疫球蛋白，但本研究发现IgM和IgG在猪乳中含量较高，表明它们在免疫转移和保护中可能具有独特功能。
关于关键代谢物，牛乳样本中最富集的物质包括刺囊酸（EA）和尿囊素。EA可通过抑制免疫细胞浸润和胶原沉积显著改善过敏炎症。尿囊素通过抑制NF-κB通路和激活AKT/Nrf2/HO-1轴来对抗炎症和氧化应激，同时调节肠道菌群。丙丁酚在人乳和牛乳中相对丰富。该化合物可通过增加树突密度和分支促进衰老小鼠学习和记忆能力的恢复。5-氨基戊酸甜菜碱（5-AVAB）在绵羊乳样本中丰度最高。它以抗氧化、抗炎和抗癌特性而闻名。此外，在山羊乳中含量最丰富的牛磺酸是支持婴幼儿生长发育的关键成分。磷酸吡哆醛在猪乳中含量最高。它可以通过激活GOT1抑制铁死亡，在治疗帕金森病等神经退行性疾病中发挥作用。其与Neu5Ac的显著相关性进一步提示了在神经元发育中的潜在协同效应。在脂质代谢水平上，研究者发现了更深入的组分间关联。在人乳中水平最高的脂蛋白脂肪酶（LPL）与特定的甘油二酯DG(36:2e)呈正相关，提示其可能通过促进DG生成影响脂质积累。
综上所述，本研究通过多组学技术系统分析了牛、绵羊、山羊、人和猪乳的功能成分谱，揭示了不同物种乳汁在支持后代发育方面具有互补的功能优先级。具体而言，基于牛乳的配方奶粉需要有针对性地强化与神经发育相关的脂质，特别是鞘磷脂和磷脂酰乙醇胺等极性磷脂，以及DHA和EPA等长链多不饱和脂肪酸，以模拟猪乳和人乳的脂质特征。同时，必须增强唾液酸化和岩藻糖基化寡糖，如3′-SL、6′-SL和Lnfp iii，以模拟人乳在促进肠道健康和免疫调节方面的核心功能。此外，可考虑添加骨桥蛋白、乳凝集素等关键功能蛋白。另一方面，需要审视和优化甘油三酯中n-6与n-3多不饱和脂肪酸的比例，以防止亚油酸（LA）等n-6脂肪酸水平过高，抑制向DHA等有益成分的转化。研究结果表明，人乳是构建免疫调节和肠道菌群轴的黄金标准。富含神经活性脂质、唾液酸化寡糖和高水平免疫球蛋白的猪乳，为神经发育和免疫支持提供了极佳的参考。同时，牛乳和山羊乳中特定生物活性成分（如黄嘌呤脱氢酶、骨桥蛋白、刺囊酸和尿囊素）的高丰度，为开发具有靶向代谢调节功能（包括抗炎和抗氧化特性）的配方提供了重要线索。总之，利用人乳的免疫微环境设计原则、猪乳的神经发育和免疫架构，并整合反刍动物乳的独特生物活性物质，将为开发下一代婴儿配方奶粉、动物代乳品和功能靶向营养产品提供研究基础。
