源驱动的装配机制差异及其对pH值改变的双蛋白共组装体结构和功能的影响

《Food Hydrocolloids》：Source-Driven Divergence in Assembly Mechanisms and its Impact on the Structure and Function of pH-Shifted Dual-Protein co-assemblies

通过pH调控法合成了乳清蛋白（WPI）与大豆蛋白（SPI）及酵母蛋白（YP）的复合体，揭示不同蛋白对的组装机制及结构-功能关系。W+S复合体因氢键作用形成有序纳米结构，表现出高乳化稳定性和强凝胶网络（G’>8000 Pa）；而W+Y和S+Y因疏水作用形成无序结构，导致凝胶强度显著降低（G’<1000 Pa）。该成果为开发功能定向的替代蛋白原料提供了理论依据。

　　

贾志芳|杨一鸣|程永强|王亮|刘军

中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京10083

摘要

为了改善替代蛋白的工艺性能，通过改变pH值实现了双蛋白复合物的源依赖性组装。研究发现，乳清蛋白（WPI）、大豆蛋白（SPI）和酵母蛋白（YP）的配对组合能够形成可溶的纳米级复合物。然而，不同共组装过程中的复杂化机制存在差异：W+S形成的共支架结构紧密有序，主要受氢键作用驱动；而W+Y在共组装过程中经历了从无序到有序的转变。SPI与YP之间的共组装则主要受非特异性疏水聚集作用支配。不同的共组装结构表现出不同的特性，这些特性又影响了它们的宏观工艺性能。共组装后乳化稳定性显著提高，但热诱导的凝胶化性质却存在根本性差异。有序的W+S复合物形成了稳定的凝胶网络（G′ > 8000 Pa），而无序的YP则破坏了W+Y和S+Y系统的凝胶强度（G′ < 1000 Pa）。这些发现表明，蛋白质伙伴的内在结构决定了它们的共组装途径和工艺性能。因此，这项研究为合理设计具有特定乳化或凝胶特性的新型成分提供了基础。

引言

在全球食品系统面临巨大可持续性转型的压力下，蛋白质来源正在发生范式转变，从传统的动物源蛋白（如乳清蛋白分离物WPI）转向植物源和微生物源替代品（Chihi等人，2018年；Ma等人，2024年）。以大豆蛋白分离物（SPI）为代表的植物蛋白以及酵母蛋白（YP）等新兴微生物蛋白受到了食品科学和工业界的广泛关注。这些蛋白质因其较低的环境影响、成本效益和资源易获取性而受到青睐。然而，要真正成为主流食品成分，替代蛋白在工艺性能和营养价值方面的固有缺陷是需要克服的关键障碍。

双蛋白系统因其在营养上的互补性和潜在的功能协同作用而成为蛋白质应用研究的重要方向（Jose等人，2016年；Lin等人，2017年）。目前最常用的方法是物理混合两种蛋白质，但这种方法在加工性能上存在明显不足。从动力学角度出发的异源共组装技术通过改变两种不同来源原材料的外部环境来诱导非共价相互作用，从而构建分子间共组装框架，使疏水基团被掩蔽、亲水基团暴露，从而在中性水系统中形成动力学稳定的复合物结构。研究表明，pH值变化引起的蛋白质构象变化可以增强异源蛋白质之间的相互作用，提高其溶解性、界面活性和稳定性（Tang等人，2021年；Wang等人，2020年）。该技术有望显著改善蛋白质的工艺性能，尤其是在植物蛋白的改性方面（Li等人，2020年；Zhu等人，2021年）。Wang等人（2019年）通过改变pH值处理将大米蛋白和乳清蛋白混合，形成了由氢键、疏水力和静电相互作用介导的复合物。这种复合物具有较高的表面电荷，有效抑制了蛋白质聚集，使大米蛋白的溶解度提高了50%以上。Hinderink等人（2019年）使用豌豆蛋白分离物（PPI）与WPI或酪蛋白钠（SC）的混合物制备了双蛋白纳米乳液。在14天的储存期内，PPI和SC稳定的乳液出现了物理不稳定性（如絮凝和聚集），而WPI-PPI或SC-PPI混合物稳定的乳液则保持稳定。对于WPI-PPI或SC-PPI混合物稳定的乳液，动物源和植物源蛋白质同时吸附在界面。如果体系中某种蛋白质的浓度足够高，它可以取代最初吸附在界面的蛋白质。在pH 12条件下将大米蛋白和鳕鱼蛋白混合制备的复合物形成了一个新的结构，其中大米蛋白为核心，鳕鱼蛋白分散在外部。此外，这两种蛋白质的氨基酸组成也达到了平衡（Wang等人，2021年）。Wu等人（2020年）发现，将扇贝肌肉蛋白（典型的疏水性水生蛋白）与大豆蛋白共组装后，其溶解度提高了95%以上。然而，pH值变化对微生物蛋白共组装的影响尚不明确。

对于通过改变pH值制备的二元蛋白复合物，乳清蛋白（WPI）因其高亲水性和溶解性而被认为是理想的伴侣蛋白。它能够显著改善植物蛋白的工艺性能。然而，关于传统植物蛋白和微生物蛋白配对组合的结构相互作用机制以及共组装的微观结构与其宏观功能之间的关系的系统比较研究仍然较少。因此，我们选择了三种来源的蛋白质（WPI、SPI和YP），通过改变pH值制备了亲水性复合物WPI+SPI（W+S）、WPI+YP（W+Y）和SPI+YP（S+Y），并对其物理化学和工艺性能进行了系统分析。利用光谱技术深入研究了共组装过程中蛋白质二级和三级结构的变化。同时探讨了共组装的微观结构属性（如粒径、表面电荷、疏水性）与其宏观工艺性能（如乳化和凝胶化性质）之间的相关性。

材料

乳清蛋白分离物（WPI，Hilmar 9410，蛋白质含量90%）购自Hilmar Cheese Company（美国加利福尼亚州Hilmar）。大豆蛋白分离物（SPI，蛋白质含量90%）购自山东生物制品有限公司（中国山东）。酵母蛋白（AnPro Yeast Protein F80EC，蛋白质含量80%）由湖北Angel Yeast有限公司提供，该蛋白是通过酶解法从啤酒酵母中提取的复合蛋白产品。本研究使用的其他所有化学试剂和材料均符合标准。

水溶性

水溶性被认为是评价蛋白质在食品系统中乳化和凝胶特性的关键指标（Du等人，2018年）。如图1所示，WPI的水溶性为74.9%，改变pH值处理后没有显著变化（Ben-Harb等人，2018年）。相比之下，SPI和YP的水溶性分别为27.7%和26.6%。这可能是由于蛋白质的提取和纯化过程导致的。

结论

本研究通过改变pH值制备了WPI、SPI和YP的二元蛋白复合物，并对其进行了系统表征。pH值变化有效促进了所有蛋白质对形成纳米级可溶性聚集体，并增加了表面电荷。然而，共组装机制和结构性质高度依赖于蛋白质的来源。W+S形成的共支架结构紧密有序，主要受氢键作用驱动；而W+Y在共组装过程中经历了从无序到有序的转变。

CRediT作者贡献声明

贾志芳：撰写初稿、软件开发和方法设计。刘军：数据验证和监督、概念构建。王亮：监督工作。程永强：监督工作。杨一鸣：方法设计、数据整理

未引用文献

Toto等人，2020年；Wang等人，2018年；Zhao等人，2022年。

利益冲突声明

所有作者声明与本文无关任何利益冲突。

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

所有作者声明与本文无关任何利益冲突。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划（2024YFF1106500）和自治区关键技术研发计划（2022A02009-3）的支持。