牛乳和山羊乳比例对奶酪抗氧化活性影响的分子机制：抗氧化肽的鉴定、筛选及其与Keap1的相互作用

《Food Research International》：Molecular mechanisms underlying the impact of bovine and caprine milk ratios on cheese antioxidant activity: Antioxidant peptide identification, screening, and interaction with Keap1

牛羊奶混合比例对奶酪抗氧化肽的影响及机制研究。采用模拟胃肠消化、超滤、纳米LC-MS/MS等技术分析不同B/C（100:0、50:50、0:100）配比奶酪的抗氧化肽特征及活性，发现低分子量肽（<3kDa）活性显著增强，鉴定出3个高吸收潜力的非毒性肽（LIRKLPFQRL、AMKPWIQPK、LNENLLRF），通过分子对接证实其稳定结合Keap1蛋白关键残基，体外实验验证其自由基清除能力。该研究为开发功能性乳制品提供理论依据。

　　

Cuisong Zhao|Xin Yuan|Zhimin Wang|Lili Jia|Chunli Ma|Dexing Ma

中国哈尔滨香坊区长江街600号，东北农业大学食品学院，邮编150030

摘要

本研究分析了不同牛乳与山羊乳比例（B/C：100:0、50:50和0:100）对奶酪抗氧化肽谱和活性的影响，并阐明了关键肽的作用机制。研究采用了模拟胃肠道消化、超滤、纳米LC-MS/MS鉴定、生物信息学筛选、分子对接和体外验证等方法。结果表明，经过模拟消化后，所有奶酪的抗氧化活性均显著增强，且活性主要集中在分子量（MW）低于3 kDa的组分中。在B/C比例为100:0、50:50和0:100的奶酪中分别鉴定出18种、38种和38种肽。这些肽主要来源于α-酪蛋白。经过筛选的三种肽（LIRKLPFQRL、AMKPWIQPK和LNENLLRF）均表现出良好的吸收潜力，并且被预测为无毒。分子对接实验表明，这些肽能够稳定结合到Keap1蛋白的活性口袋（结合能均低于-7.0 kcal/mol），并通过氢键等相互作用作用于其关键残基。体外实验证实了这些合成肽的自由基清除能力。这些发现为新型食品来源抗氧化肽的筛选和开发提供了理论基础，进一步推动了人们对乳制品来源抗氧化剂的功能理解。

引言

近年来，随着消费者健康意识的提高和营养研究的进展，天然食品中的蛋白质及其生物活性衍生物因其显著的营养价值和日益明显的生物活性功能而受到广泛关注。由于在氨基酸组成、消化率和吸收性以及生物活性功能方面的优势，牛奶和乳制品被认为是比其他天然食品更优质的蛋白质来源。除了作为营养来源外，牛奶蛋白通过酶水解或发酵可以释放出丰富的生物活性肽。研究表明，牛奶蛋白水解物和肽具有多种与健康益处相关的生物活性（Marcone, Belton, & Fitzgerald, 2017; Mohanty, Mohapatra, Misra, & Sahu, 2016），包括免疫调节、抗菌、抗高血压和抗氧化作用。

其中，抗氧化功能是这些生物活性肽最著名的功能之一。抗氧化肽通常由2至11个氨基酸残基组成（Indiano-Romacho, Fernández-Tomé, Amigo, & Hernández-Ledesma, 2019），通常含有具有抗氧化特性的特征氨基酸，如甲硫氨酸（Met）、色氨酸（Trp）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）和组氨酸（His）（Zheng, Zhao, Dong, Su, & Zhao, 2016）。这些抗氧化肽表现出较强的抗氧化性能，主要通过清除自由基、螯合过渡金属和抑制脂质过氧化来实现。此外，它们还具有多种生物调节作用，包括促进细胞内抗氧化酶的表达和减轻ROS诱导的疾病及其相关副作用（Xu et al., 2024）。

多种常见的乳制品中都检测到了抗氧化活性，包括巴氏杀菌牛奶、超高温灭菌牛奶、酸奶（Alo?lu & ?ner, 2011）和奶酪（Timón, Andrés, Otte, & Petrón, 2019）。这种活性主要归因于这些产品中含有的生物活性肽，尤其是抗氧化肽。奶酪是一种消费量大且种类多样的发酵乳制品（Bojovic & McGregor, 2023）。在加工过程中（尤其是成熟过程中），酪蛋白在凝乳酶和微生物蛋白酶的作用下被水解，释放出多种生物活性肽，如抗炎肽、抗菌肽、ACE抑制肽、免疫调节肽和关键抗氧化肽（Abedin, Chourasia, Phukon, Singh, & Rai, 2022; Singh et al., 2023）。

马拉蒂亚奶酪原产于土耳其，是一种半硬质盐水奶酪，以其独特的香气和易于切片的质地而闻名（Loudiyi & A?t-Kaddour, 2018），由山羊乳制成。与牛乳相比，山羊乳含有更高浓度的短链和中链脂肪酸（MCFAs）以及更小的脂肪颗粒，从而提高了消化率，降低了致敏性，并增强了营养价值（Wu et al., 2025）。尽管山羊乳的酪蛋白胶束较大、β-酪蛋白含量较高，钙和磷含量也较高，但由于α_s1-酪蛋白含量较低，导致凝乳硬度降低、凝胶稳定性下降和奶酪产量减少（Akshit et al., 2024）。

随着消费者对多种奶酪产品需求的增加，将山羊乳和牛乳混合用于传统奶酪制作的做法越来越受欢迎（Vyhmeister et al., 2019）。这种方法不仅有效提高了山羊乳奶酪的产量和凝胶稳定性，还通过减轻独特风味来改善其感官品质，同时扩大了消费者接受度并降低了生产成本。值得注意的是，牛乳和山羊乳在成分上存在显著差异：山羊乳含有更高比例的多不饱和脂肪酸、维生素E和内源性抗氧化剂（如硒），并且酪蛋白基因型直接影响蛋白质水解模式和肽谱组成（Tonolo et al., 2020）。这些差异可能对混合奶酪中抗氧化肽的活性水平和释放效率产生显著影响。目前，关于山羊乳和牛乳混合奶酪的大多数研究集中在不同乳比与奶酪产量、pH值及基本物理化学特性（如脂肪分布、蛋白质组成和水分含量）之间的关系上（do Egypto et al., 2013）。然而，很少有研究探讨这一比例参数对奶酪抗氧化活性的影响，更少有研究全面探讨其抗氧化肽的类型、组成和结构特征。

为此，本研究采用体外胃肠道消化模型评估了不同牛乳与山羊乳比例（100:0、50:50和0:100）对马拉蒂亚奶酪抗氧化活性的影响。通过超滤分离出不同分子量的组分，并评估了它们的抗氧化活性。随后通过纳米LC-MS/MS鉴定出具有较高抗氧化活性的组分，并进行生物信息学筛选以寻找潜在的抗氧化肽。此外，通过针对Keap1-Kelch结构域的分子对接模拟阐明了Keap1与候选抗氧化肽之间的结合机制。最后，通过体外实验验证了筛选出的肽的自由基清除能力，从而证实了它们的抗氧化效果。本研究为开发具有增强抗氧化特性的奶酪提供了理论基础，并加深了对相关机制的理解。

材料

样品中的生奶来自中国哈尔滨的多个山羊和牛群。凝乳酶和商业发酵剂（Streptococcus thermophilus和Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）从北京凯汉森有限公司（北京）购买。胃蛋白酶（1:3000）和胰蛋白酶（1:250）由美仑生物科技有限公司（大连）提供。氯化钾、氯化钠、碳酸氢钠和HPLC级乙腈也由该公司提供。

DPPH自由基清除活性

DPPH自由基因其高稳定性和易于与具有氢键供体的化合物发生电子转移反应而被广泛用作抗氧化活性的检测指标。如图1A所示，模拟胃肠道消化显著增强了所有三组奶酪的DPPH自由基清除活性（P < 0.05），这种增强主要归因于胃肠道的消化作用。

结论

本研究阐明了牛乳与山羊乳比例对奶酪抗氧化活性的影响及其背后的分子机制。模拟胃肠道消化显著提高了所有奶酪的抗氧化活性（DPPH、羟基自由基和超氧自由基清除能力、还原能力和总抗氧化活性），其中B/C比为0:100（纯山羊乳）的奶酪在消化后的活性最高。

作者贡献声明

Cuisong Zhao：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法学设计、数据分析、概念构思。Xin Yuan：数据可视化、实验设计。Zhimin Wang：撰写 – 审稿与编辑、数据管理。Lili Jia：数据可视化、软件使用、方法学设计。Chunli Ma：撰写 – 审稿与编辑、项目监督、资源协调、资金筹集。Dexing Ma：撰写 – 审稿与编辑、项目监督、资源协调、项目管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢东北农业大学乳品科学重点实验室提供的良好实验条件。本研究得到了黑龙江省自然科学基金的支持（LH2024C031）。