基于9-蒽醛和模拟肽-碱性磷酸酶融合技术的比率荧光纳米传感器驱动的双模式酶免疫测定法，用于辣椒中赭曲霉毒素A的荧光和视觉检测

《Food Research International》：Ratiometric fluorescence nanosensor-driven dual-mode enzyme immunoassay based on 9-anthraldehyde and mimotope peptide-alkaline phosphatase fusion for fluorescent and visual detection of ochratoxin A in pepper

双模式免疫分析快速检测农残 OTA，融合蛋白 MP-ALP 催化荧光纳米传感器，实现荧光/视觉检测，灵敏度达 1.5 ng/mL，成功应用于胡椒样本检测。

　　

何振云|毛福静|孙志昌|杨倩|黄迪|刘星

海南大学食品科学与工程学院，海口570228，中国

摘要

对农产品中赭曲霉毒素A（OTA）的快速灵敏监测可以将其对公共健康的威胁降到最低。本研究介绍了一种基于比率荧光纳米传感器的双模式酶免疫测定法（RFN-DEIA），用于OTA的荧光和视觉检测。在此方法中，使用了一种双功能模拟肽-碱性磷酸酶融合蛋白（MP-ALP）来竞争结合OTA特异性纳米体，并使抗坏血酸-2-磷酸脱磷酸化。通过MnO₂纳米片将基于MP-ALP的OTA免疫测定法与基于9-蒽醛的比率荧光纳米传感器连接起来。优化后的RFN-DEIA的视觉检测限（LOD）为2.75 ng/mL，仪器检测限为1.50 ng/mL。该方法对OTA具有高选择性，在回收实验中的回收率在80.66%–117.18%之间，相对标准偏差不超过9.5%。此外，RFN-DEIA被应用于实际辣椒样品的OTA检测，并通过高效液相色谱法进行了验证，证明了其在辣椒样品中检测OTA的有效性和可靠性。

引言

霉菌毒素污染在各种食品中普遍存在，如农作物、其加工产品、咖啡、坚果、葡萄酒等（González-Curbelo & Kabak, 2023）。这种污染可能发生在食品生产的各个阶段，包括原材料种植、收获、加工、运输和储存（Zhang et al., 2022）。在这些污染物中，赭曲霉毒素A（OTA）特别值得关注，因为它是由Aspergillus和Penicillium物种产生的次级代谢产物（Wang et al., 2023）。OTA主要影响肾脏，在所有单胃哺乳动物中表现出肾毒性（Samuel et al., 2021）。这种毒性归因于在服用丙磺舒期间OTA的转运和清除受到抑制，导致OTA积累超过肾脏的清除能力（Imaoka et al., 2020）。此外，OTA还表现出肝毒性，导致肝糖原积累、代谢率降低和死亡率增加（Wang et al., 2019）。OTA还具有免疫毒性和神经毒性，以及潜在的致癌、致畸和致突变作用（Guo et al., 2023; Pei et al., 2021; Sun et al., 2022）。国际癌症研究机构（IARC）将OTA归类为2B组可能的人类致癌物（Zhang et al., 2024）。尽管各国、地区或组织已经制定了OTA在食品中的最大残留限量，但霉菌毒素污染事件仍然发生，造成巨大的经济损失并对公共健康构成潜在风险（Li et al., 2022）。因此，迫切需要开发快速、准确且高度灵敏的检测方法来进行有效监测和控制。

结合高精度和高灵敏度的分析工具通常被认为是检测小分子霉菌毒素（如OTA）的最可靠方法（Algammal et al., 2021; Li et al., 2022）。然而，高设备成本、复杂的样品制备以及需要专业人员的因素限制了这些方法在偏远地区或现场即时检测中的实用性（Zhao et al., 2021）。相比之下，依赖于抗原-抗体相互作用的免疫测定技术具有简单性、快速结果和成本效益，有效解决了传统分析方法的许多限制。因此，这些技术在霉菌毒素的快速检测中受到了越来越多的关注（Tang et al., 2019; Xie et al., 2022; Yang et al., 2023）。目前，单克隆抗体（mAbs）被广泛用作免疫测定中的关键成分，例如酶联免疫吸附测定（ELISA）（Fang et al., 2024; Wu et al., 2021; Zhao et al., 2024）。虽然mAbs克服了多克隆抗体（pAbs）常见的灵敏度降低和批次间变异性问题，但其生产过程和涉及动物的伦理问题仍然存在挑战。作为可行的替代方案，来自骆驼科动物或鲨鱼的单域抗体（Nbs）成功绕过了mAbs和pAbs制备过程中遇到的许多障碍（Muyldermans, 2021; Qin et al., 2022）。与传统完整抗体相比，Nbs具有生产更简单、产量更高、溶解度更好、易于基因操作以及更容易识别隐藏表位等优点（Su et al., 2022）。因此，Nbs已被广泛应用于医疗诊断、环境监测和快速食品安全检测（Hanke et al., 2022; He et al., 2019; He et al., 2023; Liang et al., 2022）。

有毒小分子的检测通常使用竞争性免疫测定法，该方法依赖于化学合成的人工抗原（He et al., 2023; Li, Xu, et al., 2023）。然而，抗原合成的复杂性、批次间的变异性以及对操作人员的潜在健康风险显著限制了这些方法的广泛应用（You et al., 2022）。因此，大量研究表明模拟肽（MPs）或抗独特型抗体（AIDs）可以作为化学合成抗原的有效替代品，从而消除了对有害物质的需求（Peltomaa et al., 2018; Pradanas-González et al., 2023; Wang et al., 2021; Yang et al., 2023）。目前，MPs或AIDs主要通过噬菌体展示技术针对特定mAbs进行筛选获得（Ren et al., 2019; You et al., 2022）。相比之下，关于使用纳米抗体（Nbs）作为获取MPs的目标的研究还比较有限。

传统的免疫测定法需要微孔板读取器来记录吸光度值，这不利于现场检测。由于人眼对颜色变化非常敏感，因此通过视觉感知可以有效地提高检测效率。在这项研究中，我们开发了一种基于9-蒽醛的比率荧光纳米传感器，能够发出绿色或蓝色荧光信号（Das et al., 2018; Xie et al., 2014）。具体来说，9-蒽醛作为一种有机聚集诱导发光剂（AIEgen），以自由单体的形式存在于甲醇、乙醇、DMSO和DMF等合适的溶剂中。当转移到水溶液中时，它会不断聚集形成准分子，在紫外光激发下发出绿色荧光。加入Na₂SO₃后，9-蒽醛的醛基通过亲和作用发生磺化，导致准分子解离并在激发下发出蓝色荧光（Liu et al., 2022; Xie et al., 2014）。通过利用Na₂SO₃调节9-蒽醛的聚集程度来改变荧光颜色，我们建立了一种基于9-蒽醛比率荧光纳米传感器的双模式免疫测定法。该方法结合了视觉检测和仪器检测，实现了OTA检测结果的双模式传递。通过融合蛋白MP-ALP的催化作用，抗坏血酸-2-磷酸（AAP）被转化为可还原化合物抗坏血酸（AA）。随后，AA与具有过氧化物酶特性的MnO₂纳米片反应。由于MnO₂纳米片也可以氧化和催化Na₂SO₃，它们调节了基于9-蒽醛的比率荧光纳米传感器以实现OTA的检测（图1）。我们系统地研究了各种实验参数对反应系统的影响，并评估了双模式RFEIA在辣椒样品中的可行性。值得注意的是，这项研究是在我们研究小组在OTA检测领域的初步研究结果基础上逐步发展的（He et al., 2023; Mao et al., 2025）。与这些先前的研究相比，本工作有效地克服了化学发光方法难以用于现场筛查的技术瓶颈，并显著提高了该方法的环境友好性和检测稳定性。这些改进共同建立了一个实用且多功能的技术平台，用于OTA检测。

材料与试剂

四甲基氢氧化铵（TMA•OH）、Na₂SO₃、AA、AAP和四水合氯化锰（MnCl₂•4H₂O）从Aladdin Scientific（上海，中国）购买。9-蒽醛从上海宇源生物技术有限公司（上海，中国）购买。OTA免疫亲和柱以及OTA、赭曲霉毒素B（OTB）、赭曲霉毒素C（OTC）、伏马菌素B₁（FB₁）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和黄曲霉毒素B₁（AFB₁）的标准品从Pribolab（青岛，中国）采购。

Nb-C4bpα和MP-ALP的表达与表征

融合蛋白Nb-C4bpα和MP-ALP的表达和纯化通过SDS-PAGE进行分析，如图1A所示。经过自诱导后，这两种融合蛋白均成功表达，主要以可溶性蛋白的形式存在（泳道1–4, 7–10）。七聚体Nb-C4bpα是通过Nb-C4bpα融合蛋白的自组装形成的。在还原条件下，七聚体解聚为分子量约为30 kDa的单体（泳道6）。而在非还原条件下...

结论

因此，我们成功开发了一种创新的免疫测定技术RFN-DEIA，用于辣椒样品中OTA的荧光和视觉检测。RFN-DEIA基于双功能融合蛋白MP-ALP构建，结合了使用9-蒽醛作为信号转导机制的比率荧光纳米传感器。通过系统优化比率荧光传感系统和竞争性免疫测定平台的多个参数，这种双模式...

CRediT作者贡献声明

何振云：撰写——原始草稿、方法学、研究、资金获取、正式分析。毛福静：撰写——原始草稿、方法学、研究、正式分析。孙志昌：撰写——审阅与编辑、资源管理、项目管理、方法学。杨倩：验证、项目管理。黄迪：可视化、项目管理。刘星：撰写——审阅与编辑、监督、资源管理、项目管理、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（32560606, 32102067）和海南省自然科学基金（824MS074）的财政支持。