木犀草素通过破坏KEAP1-NRF2相互作用抑制铁死亡，从而减轻肾缺血-再灌注损伤

《Free Radical Biology and Medicine》：Luteoloside Attenuates Renal Ischemia–Reperfusion Injury by Suppressing Ferroptosis through Disruption of the KEAP1–NRF2 Interaction

铁死亡通过NRF2/KEAP1轴介导肾缺血再灌注损伤，芦丁（Lut）通过直接结合KEAP1的Kelch口袋抑制铁死亡，促进NRF2核转位及下游抗氧化基因表达，改善肾功能和病理损伤。

　　

邱强民|周玉杰|夏康|闫志伟|惠玉敏|陈展|于波|朱杰富|邱涛|周江桥|张晔|王天宇

中国武汉大学人民医院器官移植科

摘要

背景

肾缺血-再灌注（I/R）损伤是急性肾损伤（AKI）的主要致病因素，铁死亡（ferroptosis）被认为是其中的关键病理机制。木犀草素（Lut）是一种具有抗氧化特性的天然黄酮类化合物，但在肾I/R损伤中的作用尚未得到充分研究。

目的

本研究探讨了木犀草素的肾保护作用及其潜在机制。

方法

我们在C57BL/6小鼠中建立了肾I/R模型，并在HK-2细胞中建立了缺氧/复氧（H/R）诱导的损伤模型。通过转录组分析研究了木犀草素调控的与肾I/R相关的通路。采用H&E染色、肾功能检测和凋亡检测来评估木犀草素的保护作用，同时通过ROS检测、MDA检测、铁含量检测和扫描电子显微镜观察铁死亡相关的变化。为了阐明木犀草素的机制，我们使用了分子对接、CETSA、共免疫沉淀（Co-IP）和泛素化检测来研究木犀草素与KEAP1的相互作用及其对NRF2的调控作用。

结果

木犀草素预处理显著改善了I/R后的肾功能，表现为血清肌酐和血尿素氮水平下降，同时显著减轻了体内肾小管损伤和细胞凋亡。木犀草素减少了活性氧的积累、丙二醛水平和不稳定铁的含量，并恢复了I/R抑制的谷胱甘肽水平以及GPX4和SLC7A11的表达。转录组分析显示抗氧化和铁死亡相关通路显著富集，NRF2信号通路明显激活。机制上，木犀草素直接与KEAP1结合，破坏了KEAP1–NRF2的相互作用，抑制了NRF2的泛素化，并促进了NRF2向核内的转运。通过遗传沉默或药物抑制NRF2，显著减弱了木犀草素的抗氧化、抗铁死亡和肾保护作用。

结论

本研究表明，木犀草素通过直接调节KEAP1–NRF2轴来抑制铁死亡，从而保护肾脏免受I/R损伤，支持其作为I/R诱导的AKI的潜在氧化还原靶向治疗剂。

引言

急性肾损伤（AKI）是一种严重的全球健康问题，其特征是肾功能突然下降，与较高的发病率和死亡率相关。据估计，全球每年约有1330万患者受到影响[1]，[2]。肾缺血-再灌注（I/R）损伤在临床环境中很常见，包括肾移植、心血管手术和医院获得性AKI。病理生理学上，肾I/R损伤涉及氧化还原失衡、线粒体功能障碍、炎症级联反应和铁死亡，最终导致肾小管损伤和器官衰竭[3]。如果不及时干预，肾I/R损伤可能导致移植后移植物功能延迟和免疫介导的排斥反应[4]。目前的治疗策略仅限于管理根本病因、进行肾替代治疗和支持性护理，对预后的改善作用有限[5]。因此，寻找新的AKI治疗靶点并开发缓解损伤和促进恢复的药物至关重要。

与凋亡和坏死不同，铁死亡的特点是Fe²⁺驱动的芬顿反应、还原型谷胱甘肽（GSH）的丢失以及谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的功能障碍[6]，[7]。铁死亡在I/R损伤中起着重要作用，它介导肾小管上皮细胞的死亡[8]，[9]。抑制铁死亡可以通过抑制脂质过氧化和保护肾功能来减轻I/R-AKI模型中的肾损伤[10]。最近的研究发现了I/R-AKI中铁死亡的上游调控因子，包括控制铁代谢和脂质重塑的通路，这些通路最终都作用于GPX4依赖的防御机制[11]。这些进展表明铁死亡是肾I/R中一个可行的治疗靶点，强调了识别可操作的上游调控因子的必要性。

核因子红细胞2相关因子2（NRF2/NFE2L2）是氧化应激反应的主要转录调控因子[12]，[13]，它协调维持细胞氧化还原稳态的基因。生理上，NRF2与Kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1）结合，促进NRF2的泛素化及其随后的降解。在氧化应激期间，KEAP1发生构象变化，从而阻碍NRF2的泛素化，使其能够稳定并转运到细胞核内激活细胞保护基因的转录[13]，[14]，[15]。此外，NRF2被认为是重要的抗铁死亡调节因子[16]。首先，它上调溶质载体家族7成员11（SLC7A11）的表达，从而增加细胞内GSH水平并抑制铁死亡[17]。其次，NRF2调节GPX4的表达，后者是一种关键的酶，可抑制脂质过氧化，从而抑制铁死亡[18]。因此，NRF2在肾I/R损伤中起保护作用。相关研究表明，Nrf2敲除小鼠在I/R损伤后表现出显著的肾功能下降和抗氧化能力减弱[19]，[20]。除了依赖于KEAP1亲电修饰的经典NRF2激活策略外，还出现了一种新的方法，即通过靶向KEAP1的Kelch口袋来选择性地抑制KEAP1–NRF2蛋白-蛋白相互作用（PPI），该口袋能识别NRF2的降解基序[21]。这类非共价KEAP1–NRF2 PPI抑制剂正在积极开发中，作为一种更具选择性的稳定NRF2的方法，但Kelch口袋的参与是否能有效抑制铁死亡和减轻肾I/R损伤尚不明确。因此，针对NRF2通路是一种有前景的治疗策略。

与合成化合物相比，天然生物活性物质通常在体内具有更好的生物相容性[22]，[23]。木犀草素（Lut）是一种存在于Lonicera japonica花中的黄酮苷，具有多种生物活性，包括抗炎、抗氧化和细胞保护作用[24]，[25]。先前的研究表明，黄酮类化合物在肾I/R损伤中具有显著的保护作用[10]，[26]，[27]。最新证据还表明，木犀草素预处理可以保护新生大鼠的心肌细胞免受缺氧损伤[28]。在另一项研究中，木犀草素在脑缺血损伤中的保护作用依赖于NRF2[29]。然而，木犀草素对肾I/R损伤的影响及其是否涉及NRF2激活仍不清楚。

尽管人们对肾I/R损伤中的铁死亡和NRF2信号通路的认识日益增加，但直接调节KEAP1–NRF2轴是否是有效抑制铁死亡和减轻肾损伤的策略仍不清楚。特别是，天然黄酮类化合物木犀草素在肾I/R损伤中的作用及其与KEAP1的潜在分子相互作用尚未明确。因此，我们假设木犀草素直接作用于KEAP1，从而稳定并激活NRF2，进而抑制铁死亡并保护肾脏免受I/R损伤。为了验证这一假设，我们使用了互补的肾I/R损伤小鼠模型和HK-2细胞的体外缺氧/复氧（H/R）模型，结合转录组分析、生化和组织学分析以及分子相互作用检测，以明确木犀草素介导的肾保护机制。

实验动物

实验动物来自中国武汉大学医学院实验动物中心（体重20–25克，6–8周龄）。所有动物在武汉大学人民医院实验动物中心特定的无病原体条件下饲养，环境温度控制在24 ± 2°C，湿度控制在45 ± 5%，光照周期为12小时明/暗。动物可以自由摄取标准饲料和水。

样本量已确定

木犀草素对小鼠肾I/R损伤的保护作用

我们使用小鼠肾I/R模型来评估木犀草素的体内肾保护作用。首先优化了给药方案。如图S1A–D所示，连续三天给予80 mg/kg的木犀草素提供了最大的保护效果。关于安全性，在给予80 mg/kg的木犀草素七天后，小鼠的体重和主要器官没有出现显著变化，表明在这些条件下没有明显的毒性（图S1E–F）。图1A显示了木犀草素的化学结构。木犀草素预处理

讨论

本研究表明，木犀草素通过抑制铁死亡在肾I/R损伤中发挥肾保护作用。在体内和体外模型中，木犀草素显著减轻了I/R引起的肾功能障碍、组织损伤和细胞死亡。机制上，木犀草素减少了活性氧（ROS）、MDA和不稳定铁的积累，同时保持了线粒体的完整性，从而限制了铁死亡损伤。这种保护作用主要是通过木犀草素与KEAP1的Kelch口袋结合来实现的

结论

总之，本研究发现木犀草素主要通过抑制铁死亡来保护肾脏免受I/R损伤。机制上，木犀草素与KEAP1的Kelch口袋结合，破坏了KEAP1–NRF2的相互作用，抑制了NRF2的泛素化，并促进了NRF2向核内的转运，从而激活了抗氧化防御机制。这些发现表明木犀草素可以作为一种针对I/R诱导的AKI的潜在铁死亡靶向治疗剂。

CRediT作者贡献声明

张晔：写作——审稿与编辑、资源准备、概念构思。周江桥：项目管理、资金获取。邱涛：验证、方法学、实验设计。朱杰富：验证、软件使用、实验实施。于波：数据管理。陈展：方法学、数据管理。惠玉敏：数据管理。闫志伟：验证、软件使用、方法学。夏康：验证、软件使用、正式分析、数据管理。周玉杰：写作——初稿撰写、软件使用、实验设计、数据收集

伦理声明

动物实验遵循《巴塞尔宣言》进行。实验方案得到了武汉大学人民医院实验动物伦理委员会的批准（WDRM20230304B）。研究设计和实施遵循3R原则（替代、减少和优化），以最小化动物的使用和痛苦。

利益冲突

作者声明不存在任何可能影响本文工作的竞争利益。

数据可用性

本文的所有数据可向通讯作者索取。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（编号：82170664）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢在研究和撰写本文过程中给予我们帮助的所有人。