在AChR特异性细胞中，IRF8的高表达能够调节B细胞的功能

《Immunology Letters》：High expression of IRF8 in AChR-specific cells regulates the function of B cells

本研究通过高通量测序和免疫学方法，分析实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）模型中B细胞与T细胞中IRF8的差异表达及其机制，发现B细胞IRF8高表达与抗乙酰胆碱受体自身抗体水平正相关，提示IRF8可能作为EAMG的诊断生物标志物。

　　

赵伟|严庚|魏波|张一河|姚秀华|王振海|王光友|侯立轩|钟丽华|王静华|穆莉莉

哈尔滨医科大学基础医学科学院神经生物学系，中国哈尔滨

摘要

重症肌无力（MG）是一种自身免疫性疾病。干扰素调节因子8（IRF8）是一种常见的干扰素序列结合蛋白，它在髓系细胞的发育、成熟和抗菌活性中起着关键作用。在实验性自身免疫性MG（EAMG）大鼠和完全弗氏佐剂（CFA）处理的小鼠疾病高峰期对脾细胞进行第二代测序后发现，IRF8基因的表达与EAMG的发病机制有关。本研究重点探讨了EAMG中B细胞和T细胞中IRF8的差异表达及其在疾病发病机制中的作用机制。我们分析了CFA处理和EAMG小鼠的脾细胞基因表达谱，测量了血清中抗乙酰胆碱受体自身抗体的滴度、脾细胞中的IRF8 mRNA和蛋白质水平，以及T细胞和B细胞中IRF8的mRNA和蛋白质表达情况，并使用共聚焦显微镜观察了CD45R和IRF8蛋白的共定位。最终，我们测定了LPS刺激细胞上清液中的抗乙酰胆碱受体自身抗体滴度。研究结果表明，在EAMG高峰期，脾细胞中IRF8的表达增加，B细胞中的IRF8表达水平较高，且B细胞中的IRF8表达与抗体分泌呈正相关。综上所述，我们的发现表明IRF8可能是EAMG的潜在生物标志物。

引言

重症肌无力（MG）是一种由自身抗体引起的自身免疫性疾病，这些抗体针对神经肌肉接头（NMJ）。MG的发病机制主要归因于存在特异性针对乙酰胆碱受体（AChR）、肌肉特异性激酶或其他AChR相关蛋白的自身抗体，从而阻碍了NMJ处的电化学信号传导。抗AChR抗体介导的MG是最主要的形式，其中自身抗体激活补体并破坏突触后膜完整性，同时通过抗原调节与相关基因交联来抑制AChR的合成。MG患者通常表现为肌肉无力，这种症状在重复性肌肉收缩时通常会加重[1]。 随着先天免疫研究的进展，现在普遍认为感染诱导的先天免疫反应可以产生适应性免疫反应所需的炎症环境。在MG的进展过程中，慢性炎症环境通过涉及Toll样受体（TLR）等途径的正反馈机制加剧了疾病[2]。 研究表明，Epstein-Barr病毒通过TLR信号通路触发胸腺对AChR的自身免疫反应，而干扰素（IFN）-β是先天免疫和适应性免疫之间的中介[3][4][5][6][7][8]。同时，先天免疫系统中的不同亚群自然杀伤（NK）细胞在MG的发病机制中可能具有相反的作用[9][10][11][12]。致病性抗AChR抗体的合成（其特征是高亲和力的IgG）会诱导活化的CD4⁺ T细胞和B细胞之间的相互作用。通过腹腔途径给予B022（NF-kappaB诱导激酶抑制剂）可以减轻大鼠EAMG的严重程度，同时减少致病性B细胞和T细胞亚群的比例，降低抗体水平，并减轻突触后膜损伤[13]。使用免疫抑制剂特立氟尼莫德治疗后，EAMG的发病率、抗MuSK抗体的水平以及NMJ沉积均有所下降，记忆B细胞的比例也有所降低。单细胞测序技术也证实了中性粒细胞-B细胞激活因子（BAFF）-浆细胞轴在MG中的作用[15]。 干扰素调节因子8（IRF8），也称为干扰素共识序列结合蛋白，是由IRF8基因编码的转录因子，在调节谱系分化和髓系细胞成熟中起关键作用。具体而言，它控制经典髓系祖细胞向单核细胞前体的分化。IRF8缺乏会导致严重的原发性免疫缺陷，表现为DC亚群的严重或完全耗竭，CD14⁺和CD16⁺单核细胞的丢失，以及NK细胞数量减少和功能受损[16,17]。IRF8在NK细胞介导的抗病毒免疫的细胞类型特异性调节及其发育中起着关键作用[18,19]。在特异性免疫中，IRF8可能在B细胞及其谱系发展的早期阶段起重要作用，先前的研究报道了pro-B细胞和pre-B细胞系中IRF8的高表达，表明其可能参与B细胞发育的初始阶段[20][21][22][23]。在T细胞中，IRF8依赖的DC在维持肠道T细胞稳态中发挥多种作用[24]。Treg细胞中IRF8的高表达表明其参与Treg细胞的功能和多种Treg细胞亚群中的细胞因子表达调节[25][26][27]。在炎症反应的背景下，炎性小体的激活对于宿主有效对抗多种微生物感染至关重要。作为NAIPs的关键上游调节因子，IRF8增强了NLRC4炎性小体的活性，这意味着NAIPs的转录调节依赖于IRF8[28,29]。此外，研究表明IRF8促进IL-12和IL-23的合成，同时抑制IL-27的生成，从而创造出有利于Th1和Th17细胞增殖和持续存在的细胞因子环境。此外，它通过激活小胶质细胞加剧神经炎症，因此可能是多发性硬化症的一个诱发因素[30]。 本研究重点探讨了EAMG中T细胞和B细胞中IRF8表达的差异及其在EAMG发病机制中的作用机制。

动物

实验所用动物为6–8周龄的雌性Lewis大鼠（体重150g–170g），购自北京Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.，并饲养在哈尔滨医科大学的动物设施中。动物以每笼3只的形式饲养，处于12小时光照/12小时黑暗的周期下，温度为23°C，可自由获取标准实验室饲料和水。使用乙醚深度麻醉后处死动物。在免疫前先使用2%异氟醚进行低剂量麻醉。

免疫和临床检查

EAMG模型的成功建立

Lewis大鼠被随机分为两组：CFA组和EAMG组，第0天进行初次免疫，第30天再次免疫。对两组进行了EAMG模型的国际临床评分。初次免疫后第34天开始，EAMG组的临床评分显著高于CFA组（图1B）。初次免疫后第28天收集了顶部分血液样本。

讨论

EAMG是一种由B细胞介导并依赖于T细胞的自身免疫性疾病。特异性针对AChR的Th1细胞通过产生促炎细胞因子（如IFN-γ和IL-2）促进B细胞分泌自身抗体[31]。为了进一步研究致敏的AChR特异性细胞与CFA组细胞之间的差异，我们对两组细胞进行了下一代测序。在表现出显著差异表达的多个基因中，IRF8（属于IFN家族）是一个重要的候选基因。

CRediT作者贡献声明

赵伟：资金获取、概念构思。 严庚：软件开发。 魏波：初稿撰写、正式分析。 张一河：方法学设计、实验实施、资金获取。 姚秀华：方法学设计、实验实施、资金获取。 王振海：数据管理。 王光友：项目监督。 侯立轩：数据管理。 钟丽华：数据可视化。 王静华：项目监督、项目管理、概念构思。 穆莉莉：初稿撰写与编辑、项目监督、资金获取。