《Industrial Crops and Products》：Silk fibroin scaffolds enriched with mulberry extract: Structure, controlled antioxidant release and fibroblast response for regenerative applications
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本文为解决生物活性功能与结构性能难以兼顾的再生医学材料难题，研究人员开展了“桑葚提取物（ME）增强丝素蛋白（SF）支架”的研究。通过优化制备参数（蛋白浓度、冷冻温度），成功构建了具备可控孔结构、可调力学性能与抗氧化剂（ME）缓释功能的复合支架，并证实其可支持成纤维细胞（NIH-3T3）粘附与增殖。这项研究为开发多功能、生物活性的组织工程支架提供了新策略。
在探索自然以获取灵感设计先进生物材料的浪潮中，再生医学领域正致力于寻找既能模拟细胞外基质、提供物理支撑，又能主动调节局部微环境、促进组织修复的“智能”支架材料。丝素蛋白（SF），这种来自家蚕（Bombyx mori）的天然蛋白质，因其优异的生物相容性、可生物降解性和良好的机械性能，已成为组织工程领域的明星材料。然而，单纯的SF支架通常缺乏生物活性功能，难以应对组织修复初期常见的氧化应激、炎症等挑战。与此同时，自然界中存在丰富的植物源生物活性化合物，桑葚（Morus alba）——家蚕的主要食物来源——的提取物富含多酚、黄酮类化合物，具有强大的抗氧化、抗炎和再生潜力。一个自然而巧妙的问题是：能否将桑葚提取物（ME）与丝素蛋白结合，创造出一种既继承丝素优良结构特性，又具备桑葚生物活性的“强强联合”型复合支架？这不仅能赋予材料新的功能，也契合了从农业食品副产品中挖掘价值的循环经济理念。为此，由Livia Ottaviano、Giorgia Maurizi、Marianna Barbalinardo、Luana Mariani、Maria Luisa Navacchia、Franco Corticelli、Giampiero Ruani、Giovanna Sotgiu、Roberto Zamboni、Annalisa Aluigi和Tamara Posati组成的研究团队，在《Industrial Crops and Products》上发表了他们的研究成果，系统回答了如何构建、调控并验证这种多功能SF/ME支架的性能。
研究人员开展这项研究，主要运用了几项关键技术方法。首先是材料的制备与表征：从家蚕茧中提取并再生丝素蛋白溶液，同时从桑葚鲜果中用水提法获得ME；通过调控丝素蛋白浓度（2.5% 和 5.0% w/v）和冷冻温度（-20°C, -40°C, -80°C, -196°C），结合冷冻干燥技术制备了纯SF（白色）和SF/ME复合海绵支架。其次是系统的性能表征：利用扫描电子显微镜（SEM）分析支架的微观形貌和孔径分布；通过衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）分析蛋白质的二级结构（如β-折叠含量）；采用液体置换法测定孔隙率，并测试了支架在磷酸盐缓冲液（PBS）中的溶胀行为和在不同条件下的（湿/干）压缩力学性能（杨氏模量、形状恢复率）及蛋白酶XIV介导的生物降解性。再者是对ME及其释放行为的分析：利用高效液相色谱-紫外-质谱联用（HPLC-UV-MS）鉴定ME中的主要活性成分（如花青素、咖啡酰奎宁酸异构体）；通过DPPH自由基清除实验评估其抗氧化活性；在PBS缓冲液中监测ME从支架中的释放动力学，并用Korsmeyer-Peppas和Peppas-Sahlin模型拟合以揭示释放机制。最后是生物学评价：使用小鼠胚胎成纤维细胞（NIH-3T3）与支架共培养，通过刃天青（resazurin）还原法评估细胞活性，并通过荧光显微镜（TRITC-鬼笔环肽标记肌动蛋白，DAPI标记细胞核）观察细胞的粘附和形态。
3.1. 白色SF海绵的制备
研究人员通过冷冻干燥SF水溶液成功制备了3D海绵支架，并系统改变了蛋白浓度和冷冻温度这两个关键参数。如图1所示，添加了甘油作为塑化剂，以诱导材料不溶于水并优化其性能。
3.2. SF海绵的形态学表征
SEM分析（图1）显示，冷冻温度对支架形态的影响比蛋白浓度更显著。在-20°C下冷冻得到的是具有相互连通圆形孔洞的多孔结构，平均孔径较大（SF 2.5%: 169 ± 49 μm; SF 5.0%: 144 ± 36 μm）。随着冷冻温度降低，孔洞逐渐从圆形变为细长、径向排列的形态。孔隙率也随温度降低而减小，从-20°C时的约94%（SF 2.5%）降至-196°C时的约70%（SF 5.0%）。溶胀比测试（图2B）表明，较低的蛋白浓度和较高的冷冻温度（即更大的圆形孔洞）对应着更高的液体吸收能力。
3.3. 支架的结构表征与稳定性
ATR-FTIR光谱分析（图3A）显示，所有海绵在1515、1620和1700 cm-1处均显示出特征吸收峰，表明存在不溶于水的β-折叠晶体结构（Silk II），这主要归因于甘油的诱导作用。在PBS中浸泡12天的质量损失实验表明，所有支架在初始约20%的质量损失（可能为甘油溶出）后保持稳定。蛋白酶降解实验（图3B）则表明，支架的酶解稳定性与蛋白浓度和结构致密性正相关：SF浓度越高、冷冻温度越低（结构更致密）的支架降解越慢。例如，SF 2.5% -20°C的海绵在24小时内完全降解，而SF 5.0% -196°C的海绵在6天后才损失约70%的质量。
3.4. 海绵的力学性能
压缩测试表明（图4，表1，2），支架的应力-应变曲线呈现典型的粘弹性行为，包括线性弹性区、屈服区和致密化区。在干燥状态下，杨氏模量随冷冻温度降低（结构更致密）和蛋白浓度增加而增加，形状恢复率则呈现相反趋势。例如，SF 5.0% -20°C的支架最柔软（杨氏模量0.56 MPa），形状恢复率最高（94.0%），而SF 2.5% -196°C的支架最硬（3.48 MPa），形状恢复率较低（39.9%）。在湿润状态下，所有支架的杨氏模量显著降低，形状恢复率升高，且致密化区变窄，这是由于水分子起到了润滑和软化作用。
3.5. 桑葚提取物的表征及其在SF海绵中的掺入
从桑葚鲜果中获得的水提物（ME）经HPLC-UV-MS分析，主要成分为花青素（如矢车菊素-3-芸香糖苷）和咖啡酰奎宁酸异构体等多酚类化合物（表3）。DPPH实验证实ME具有抗氧化活性，其半数有效浓度（EC50）为1.2 mg（图5）。将20% w/w的ME成功掺入SF海绵中，形成了SF/ME复合支架（图5插图）。ME的掺入对SF基质的二级结构、形态和力学性能影响甚微，表明支架的主要性能仍由丝素蛋白基质主导。
3.6. ME从SF海绵中的释放
ME从不同SF海绵中的释放曲线显示（图6），在PBS (pH 7.4)中，ME的释放是渐进式的，SF 2.5%/ME和SF 5.0%/ME海绵分别在约16小时和25小时后释放接近完全。释放动力学数据用Korsmeyer-Peppas和Peppas-Sahlin模型拟合良好（表4）。所有样品的释放指数n均小于0.5，且Peppas-Sahlin模型中的k2值为负或接近于零，表明ME的释放主要受菲克扩散（Fickian diffusion）控制，而非基质溶胀主导。冷冻温度对释放速率无显著影响，但更高蛋白浓度（5.0%）的支架表现出更快的释放动力学常数。重要的是，对释放出的ME进行DPPH测试表明，其抗氧化活性与游离提取物相比仅损失约5-7%，证明在掺入和释放过程中活性得到了良好保持。
3.7. 生物相容性
使用NIH-3T3成纤维细胞对支架进行了初步生物相容性评价。细胞活性测试（图7，8）显示，在培养24小时时，所有支架上的细胞粘附率均较低（约40-50%），这可能与其高孔隙率和相对较小的孔径（~144-169 μm）不利于早期细胞锚定有关。但此后细胞开始适应并增殖，在48小时和72小时后，活性显著提升。培养72小时后，所有支架均表现出良好的生物相容性，细胞活性均超过60%。其中，SF 2.5% -20°C和-40°C的海绵细胞活性最高（分别达96%和89%），SF 5.0% -80°C的海绵也达到90%。特别值得注意的是，在SF 2.5% -196°C的海绵中掺入ME，显著增强了成纤维细胞的粘附和增殖：培养72小时后，含ME的支架上细胞活性达到110%，比不含ME的对照组高出约10%（图8B）。荧光显微镜图像（图9）直观地印证了这一点：在SF -196°C ME样本上，可见均匀铺展的细胞层，表明细胞粘附和生长状态更佳。
综上所述，本研究成功地开发并系统表征了一种新型的、功能可调的桑葚提取物增强丝素蛋白海绵支架。通过精确控制制备过程中的蛋白浓度和冷冻温度，可以有效地调控支架的孔隙结构、力学性能、溶胀行为、降解速率以及生物活性分子的释放动力学。研究证实，ME的成功掺入为支架赋予了抗氧化功能，且该活性在释放过程中得以保留。初步的细胞实验表明，该支架支持成纤维细胞的生长，并且ME的加入在特定制备条件下（如SF 2.5% -196°C）能进一步促进细胞活性和增殖。这项工作的意义在于，它首次将桑树（家蚕的自然食物来源）果实提取物作为功能剂引入丝基支架，创造了一种结合了丝素蛋白优异机械/生物特性与桑葚天然生物活性的“双功能”材料。这不仅为组织工程和再生医学，特别是伤口愈合领域，提供了一种具有结构支撑和主动调节微环境潜力的新型多功能支架候选材料，也体现了从农业副产品中开发高附加值生物材料的循环经济理念。尽管仍需进一步的体内外研究来验证其临床应用潜力，但本研究为基于天然聚合物的活性生物材料设计提供了重要的理论依据和工艺参考。
