靶向VDAC1依赖性的线粒体DNA（mtDNA）释放可减弱成纤维细胞的先天免疫反应及白癜风的发病机制

《International Immunopharmacology》：Targeting VDAC1-dependent mtDNA release attenuates fibroblast innate immune activation and vitiligo pathogenesis

氧化应激通过VDAC1介导的线粒体DNA泄漏激活cGAS-STING/NLRP3通路，驱动皮肤成纤维细胞分泌SASP相关炎症因子，破坏黑色素细胞。抑制VDAC1寡聚化可阻断mtDNA泄漏，减轻炎症并促进小鼠模型复色。

　　

Jinpeng Lv|张焕莎|于文豪|姜佩文|尹传伟|徐文辉|曹燕|高荣银

中国江苏省常州市常州大学药学院药物智能制造与精准递送工程研究中心，邮编213000

摘要

白癜风是一种由氧化应激引发的慢性色素脱失性疾病，氧化应激会激活炎症信号通路和先天免疫系统，最终导致黑色素细胞破坏。尽管黑色素细胞的缺陷已被广泛研究，但作为皮肤免疫主要基质调节细胞的真皮成纤维细胞在白癜风发病机制中的作用仍不够明确。在本研究中，我们发现正常人真皮成纤维细胞（NHDFs）在亚毒性氧化应激下会释放线粒体DNA（mtDNA），这一过程不涉及细胞凋亡，从而将氧化还原失衡与免疫激活联系起来。低剂量过氧化氢能够保持线粒体结构完整，同时促进VDAC1寡聚化，形成孔道使mtDNA从结构完好的线粒体中选择性释放。释放的mtDNA激活了cGAS-STING通路和NLRP3炎性体，驱动IL-1β、IL-6、ICAM-1和Occludin的表达，这种表现与衰老相关的分泌型特征一致。使用溴化乙锭（Ethidium bromide）、RU.521、VBIT-4和外源性mtDNA进行的药理学干预证实了mtDNA释放是成纤维细胞先天免疫激活的上游事件。值得注意的是，用VBIT-4抑制VDAC1寡聚化能有效阻止mtDNA泄漏，减轻成纤维细胞衰老和炎症反应，并在白癜风小鼠模型中恢复表皮色素沉着。这些发现表明真皮成纤维细胞通过VDAC1-mtDNA-cGAS-STING轴成为氧化应激的主动感知和放大器，提示VDAC1寡聚化是一个有前景的治疗靶点。

引言

白癜风是一种常见的自身免疫性疾病，其特征是选择性黑色素细胞丢失和皮肤色素脱失，影响全球0.5–2%的人口[1]、[2]。尽管大量研究集中在免疫介导的黑色素细胞破坏上，但白癜风中先天免疫微环境的建立和持续机制仍不清楚[3]、[4]、[5]。最新研究表明，真皮成纤维细胞作为皮肤的主要基质细胞，在疾病进展中起关键调节作用[6]。值得注意的是，无论是病变区还是非病变区的白癜风皮肤中的成纤维细胞都表现出与衰老相关的表型（SASP）[7]、[8]、[9]。SASP通过引发慢性低度炎症，促进局部和全身性的先天免疫激活，成为白癜风发病机制的关键因素[10]。

这些SASP因子维持了一个促炎微环境，将成纤维细胞衰老与免疫激活和黑色素细胞功能障碍联系起来，包括促炎细胞因子和趋化因子（如IL-1β、IL-6、CXCL9、CXCL10），这些因子会招募细胞毒性CD8⁺ T细胞[7]、[11]；Wnt抑制剂DKK1会抑制黑色素细胞分化和存活[12]、[13]；以及促进T细胞滞留和放大局部免疫反应的粘附分子（如Occludin、ICAM-1）[14]、[15]。这种炎症环境的产生主要由氧化应激引起。虽然多项研究证实氧化应激是SASP的驱动因素[16]、[17]、[18]，但其具体机制细节仍不明确。一个主要途径涉及氧化应激诱导的核DNA损伤及其随后的细胞质泄漏，这会激活cGAS、STING和NF-κB级联反应，从而促进SASP和细胞衰老[19]。除了核DNA外，由于线粒体对活性氧的高度敏感性，它们也成为细胞质DNA的主要来源[20]。在白癜风中，检测到了细胞质和循环中的mtDNA，表明mtDNA泄漏与疾病中的先天免疫激活有关[21]。此外，在皮肤老化模型中，成纤维细胞的线粒体功能障碍通过mtDNA释放和cGAS-STING-NF-κB通路的激活促进细胞衰老、慢性炎症和SASP分泌[22]。综上所述，氧化应激诱导的mtDNA释放通过cGAS-STING信号通路驱动SASP的形成，将氧化还原失衡与白癜风的慢性炎症微环境联系起来。

目前研究重点在于线粒体完整性破坏和mtDNA释放的机制，已有几种途径被详细阐明。BAX/BAK大孔形成可同时释放mtDNA和促凋亡因子，最终导致程序性细胞死亡[23]、[24]；而VDAC1寡聚化则形成选择性孔道，仅允许mtDNA泄漏而不释放促凋亡介质，使细胞保持存活[25]。在白癜风背景下，我们之前的研究表明氧化应激会触发黑色素细胞中的VDAC1依赖性非凋亡性mtDNA释放，激活先天免疫信号[21]。值得注意的是，疾病后期黑色素细胞逐渐减少，而真皮成纤维细胞在病变区和病变周围皮肤中持续存在，组织病理学检查未发现明显结构异常[26]。这些观察表明，成纤维细胞中的mtDNA泄漏和随后的SASP诱导可能是一种持续维持促炎微环境的机制，而不仅仅是早期的短暂反应。理解非凋亡性mtDNA释放的分子途径及其引发的下游炎症级联反应对于解释白癜风进展过程中的皮肤炎症环境至关重要。

在本研究中，我们发现亚毒性氧化应激可诱导真皮成纤维细胞中的mtDNA泄漏，而不影响核或线粒体的完整性。这种细胞质mtDNA随后激活cGAS-STING通路，驱动与黑色素细胞功能障碍相关的SASP相关炎症因子的分泌。重要的是，体外药理学抑制VDAC1寡聚化可抑制mtDNA释放和下游炎症反应。关键的是，这种治疗策略在体内也显示出疗效，VDAC1抑制有效减轻了皮肤炎症并促进了白癜风小鼠模型的色素沉着。因此，我们的结果确立了mtDNA泄漏作为氧化应激与白癜风中成纤维细胞介导的炎症之间的关键早期事件。更重要的是，VDAC1被确定为潜在的治疗靶点，其抑制可能调节局部炎症微环境并促进黑色素细胞存活。

细胞培养和处理

根据伦理指南，从健康捐赠者的包皮标本中分离出正常人真皮成纤维细胞（NHDFs）。细胞在添加了10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养，置于37°C、5% CO?的潮湿培养箱中。为了诱导氧化应激，用指定浓度的H₂O₂（21,040,210，Yonghua Chemical）处理NHDFs。其他处理包括使用溴化乙锭（EtBr，HY-D0021，MedChemExpress）和RU.521

亚毒性H?O?在NHDFs中诱导细胞衰老和SASP相关因子

为了模拟体外正常人真皮成纤维细胞（NHDFs）中的氧化应激诱导的衰老，我们首先参考了先前报道的H?O?处理方案。在NIH3T3细胞（一种小鼠胚胎成纤维细胞系）中，短暂暴露于H?O?（400 μM，45分钟），随后在完整培养基中培养24–72小时，可诱导细胞衰老[19]。相比之下，使用来自白癜风患者或健康捐赠者的成纤维细胞的研究通常采用长期低剂量处理

讨论

本研究探讨了真皮成纤维细胞在白癜风中对氧化应激的早期反应，研究了亚毒性应激是否独立于细胞凋亡诱导mtDNA释放、下游炎症信号和早期衰老。先前的研究表明，细胞应激可导致线粒体结构损伤和功能障碍，促进mtDNA泄漏到细胞质中并激活cGAS-STING通路[38]、[39]、[40]。在这里，我们观察到了不同的现象

CRediT作者贡献声明

Jinpeng Lv：撰写初稿、监督、项目管理和资金申请。Huansha Zhang：撰写初稿、验证、实验设计和数据管理。Wenhao Yu：验证、数据管理。Peiwen Jiang：验证、数据管理。Chuanwei Yin：验证、实验设计和数据分析。Wenhui Xu：验证、实验设计和数据分析。Yan Cao：资源协调、项目管理和资金申请。Rongyin Gao：撰写、审稿和编辑、项目统筹

伦理批准

正常人真皮成纤维细胞（NHDFs）从健康捐赠者的包皮标本中分离。所有参与者均签署了符合赫尔辛基宣言的书面知情同意书，本研究获得了南京医科大学第三附属医院临床研究伦理委员会和伦理审查委员会的批准（批准编号[2024]KY029-01D）。所有动物实验程序均获得了常州市动物护理和使用委员会的批准

资助

本研究得到了国家自然科学基金（资助编号[82103752]）、江苏省研究生研究与实践创新计划（资助编号[SJCX25_1693]、常州市科技创新计划（资助编号[CJ20253085]）、江苏省青兰计划、南京医科大学常州市医学中心计划（资助编号[CMCC202408]、南京医科大学教育研究项目（资助编号[2023LX098]）的支持

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究。