基于结构的模块化RNA适配体生物传感器工程设计，用于circRNA的一锅法多重检测

《International Journal of Biological Macromolecules》：Structure-guided engineering of modular RNA aptamer biosensors for one-pot, multiplex detection of CircRNAs

本研究开发了一种模块化荧光RNA aptamer生物传感平台（FRA-MOML），通过ligase-assisted assembly将环状RNA的BSJ结构特异性转化为可扩增的DNA模板，结合T7聚合酶扩增产生结构特异性荧光aptamer，实现单分子级灵敏度（fM）和多靶点检测，在血清、细胞系及肿瘤组织中验证了其有效性和普适性。

　　

姚福|裴雪娟|陈成|李英凡|钱学宏|马静|张莉|邓世雄

重庆医科大学法医学系，中国重庆，400016

摘要

环状RNA（circRNAs）是一类内源性生物大分子，其特征是具有共价闭合的单链结构，这种结构赋予了它们极高的稳定性和序列特异性的反向剪接接头（BSJs）。利用这些独特的结构特征进行诊断仍然具有挑战性，尤其是在多重检测格式中。在这里，我们报告了一个模块化的生物传感平台，该平台将circRNA BSJ识别的结构特异性与工程化RNA适配体的构象依赖性荧光发射相结合。该系统被称为FRA-MOML，它利用连接酶辅助组装将目标识别转化为可转录的DNA模板，然后通过T7 RNA聚合酶扩增以产生荧光RNA适配体（例如iSpinach和Mango）。这些适配体在折叠成其特定的三维结构后，会与小分子荧光团结合并发出不同的荧光信号。通过将结构识别模块（探针）与产生信号的大分子（适配体）分离，我们的平台实现了飞摩尔级别的灵敏度、出色的单核苷酸区分能力（尤其是在结构关键的连接处），以及无需标记探针即可进行的一锅多重检测。我们通过在复杂的生物基质中同时定量两种与膀胱癌相关的circRNAs（circSMARCA5和circSLC38A1）来验证了这种基于结构的设计，这些基质包括血清、细胞系和肿瘤组织。这种基于核酸模块化架构的可插拔编程性，不仅适用于circRNA检测，也适用于研究各种生物大分子的结构-功能关系。

引言

环状RNA（circRNAs）因其共价闭合环结构、高稳定性和细胞类型特异性表达模式而成为癌症诊断和治疗监测的强大生物标志物[1]、[2]、[3]。最近的研究表明，与单一标志物相比，多重circRNA检测面板可以提供更高的诊断和预后准确性[4]。它们的共价闭合环构象不仅赋予了极高的核酸酶抗性，还呈现了一个独特的反向剪接接头（BSJ）结构基序，这是区分它们与线性RNA异构体的决定性特征。这一特定的结构特征为设计高选择性检测平台提供了理想的目标。然而，目前的金标准检测方法，如逆转录定量PCR（RT-qPCR）和微阵列，通常涉及复杂的多步骤工作流程，这限制了它们在多重、即时检测应用中的可扩展性和实用性[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。

基于等温扩增的生物传感器因其操作简单、高灵敏度和与一锅反应格式的兼容性而受到了广泛关注[11]、[12]、[13]、[14]。例如，郭等人开发了一个双模原位检测平台，将杂交链反应（HCR）与机器学习相结合，实现了无需热循环或RNA提取即可对circRNAs进行超灵敏检测[15]。同样，沙等人利用等温扩增的快速性和无需设备的特性，结合CRISPR-Cas与引物交换反应（PER），实现了2.13 fM的circRNA检测灵敏度——这一灵敏度可与qPCR相媲美，且无需复杂的仪器[16]。尽管有这些优势，但大多数报道的等温生物传感器仍然仅限于单一目标检测，限制了它们在复杂诊断场景中的应用。这一限制存在于各种扩增策略中，包括环介导的等温扩增（LAMP）[17]、[18]、滚环扩增（RCA）[19]、[20]、[21]、链置换扩增（SDA）[22]、催化发夹组装（CHA）[23]和杂交链反应（HCR）[24]、[25]。虽然一些最近的研究引入了多重检测策略，但这些策略通常依赖于荧光标记的探针，增加了检测成本、设计复杂性和潜在的特异性问题。例如，张等人报道了一种用于多重circRNA检测的连接控制单分子生物传感器，这需要多个荧光标记的DNA探针，从而增加了成本和设计复杂性[26]。同样，谭等人基于CRISPR-Cas13a/Cas12a建立了一个用于双重circRNA检测的系统[27]。

相比之下，无标记荧光生物传感器，特别是那些利用荧光RNA适配体（FRAs）的传感器，具有显著的优势[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]。FRAs（如iSpinach和Mango）是一类功能性核酸结构，它们能够精确地三级折叠形成与小分子染料结合的口袋，将结构转换成荧光信号[36]、[37]。这种固有的结构-功能耦合提供了低成本和优异的生物相容性。然而，迄今为止大多数基于FRA的方法仍然仅限于单一目标检测，而一个强大、无标记、能够进行多重circRNA分析的一锅平台仍然不存在。为了克服当前多重无标记检测的局限性，我们开发了一个基于荧光RNA适配体的模块化、一锅、多重的无标记检测系统（FRA-MOML）。该系统能够实现一步、高灵敏度地检测多种circRNAs（检测限可达到飞摩尔水平）。该系统被设计为直接将circRNA BSJ的结构识别转化为不同结构活性荧光RNA适配体的从头合成。核心设计将目标识别（通过可编程探针）与信号放大（通过T7转录下的FRA表达）分开，从而无需重新优化反应即可实现新目标的即插即用检测。使用与膀胱癌相关的生物标志物circSMARCA5 [38]和circSLC38A1 [39]，我们在复杂样本中成功实现了同时检测。

寡核苷酸和化学品

所有寡核苷酸（表S1）均由Sangon Biotech（中国上海）合成，并通过高效液相色谱（HPLC）纯化。以下试剂从商业来源获得：T7 RNA聚合酶（50,000 U/mL）、SplintR连接酶（25,000 U/mL）和rNTPs（25 mM）购自New England Biolabs（中国）。TO1-生物素购自Applied Biological Materials（中国），DFHBI-1T购自MedChemExpress（中国）。混合人血清来自

FRA-MOML生物传感器的原理

如图1所示，FRA-MOML生物传感器由两个关键的寡核苷酸探针组成：启动子探针（P探针）和报告探针（R探针）。P探针具有一个茎环结构，其中包含T7 RNA聚合酶启动子和一个5′磷酸化的上游连接识别域（uLRD），该域可以结合circRNA反向剪接接头（BSJ）以促进连接酶介导的连接。R探针具有一个3′下游连接识别域（dLRD）

结论

总之，通过将BSJ特异性识别元件与结构转换荧光适配体报告器模块化地结合，我们创建了一个多功能平台，该平台可以直接将分子结构信息转化为可放大的荧光信号。该系统将连接酶介导的目标识别与T7 RNA聚合酶驱动的转录相结合，并使用光谱不同的适配体-染料对（iSpinach/DFHBI-1T和Mango II/TO1-生物素）作为荧光信号报告器，从而

CRediT作者贡献声明

姚福：写作 – 审稿与编辑、撰写原始稿件、可视化、验证、软件开发、概念化。裴雪娟：写作 – 审稿与编辑、可视化、验证、软件开发、数据分析。陈成：写作 – 审稿与编辑、验证、软件开发、方法学。李英凡：写作 – 审稿与编辑、软件开发、方法学。钱学宏：写作 – 审稿与编辑、软件开发、方法学。马静：写作 – 审稿与编辑、软件开发、方法学。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了重庆市自然科学基金（cstc2021jcyjmsxmX0485）的财政支持。