综述：克鲁兹锥虫碳酐酶抑制剂作为潜在的抗寄生虫药物

《International Journal of Biological Macromolecules》：Trypanosoma cruzi carbonic anhydrase inhibitors as a potential antiparasitic agent

美洲锥虫病碳ic anhydrase抑制策略研究中，发现两种新型抑制剂1h和1j在体外和3D心脏类器官模型中显著抑制寄生虫增殖，其中1j在等效浓度下寄生虫抑制率（74%）接近苯甲醇肼（Bz）但更安全，且与Bz联用呈现协同效应。

　　

Sarah da Costa Lanera | Leonardo da Silva Lara | Lorraine Martins Rocha Orlando | Thamyris Pérez de Souza | Edinaldo Castro de Oliveira | Victoria Barbosa Paes | Nathalia da Silva Figueiredo | Simone Giovannuzzi | Anna Nikitjuka | Alessio Nocentini | Jean-Yves Winum | Ver?nica da Silva Cardoso | Edilma Paraguai de Souza Dias | Alane Beatriz Vermelho | Claudiu T. Supuran | Mirian Claudia de Souza Pereira

细胞超微结构实验室，奥斯瓦尔多·克鲁兹研究所（Fiocruz），巴西里约热内卢Manguinhos大街4365号，邮编21040-900

摘要

查加斯病仍然是一个重大的全球健康挑战，这凸显了开发更安全、更有效的治疗方法的必要性。在这里，我们发现抑制碳酸酐酶是一种针对克鲁兹锥虫（Trypanosoma cruzi）的可行化疗策略。两种TcCA抑制剂1h（IC?? = 6.98 μM；SI > 71.6）和1j（IC?? = 3.69 μM；SI > 135.5）在感染了Dm28c-萤光素酶的Vero细胞中表现出强大的选择性活性，并且对心脏肌肉细胞中的T. cruzi Y菌株也有效。在3D心脏球体模型中，这两种TcCA抑制剂显示出较低的细胞毒性，在2×IC??浓度下分别实现了87%（1h）和74%（1j）的寄生虫抑制效果，优于相同浓度（20 μM）下的苯尼达唑（Bz，抑制率为69%）。值得注意的是，1j的杀锥虫效果与高剂量Bz（100 μM）相当，能够长期抑制寄生虫的复发。此外，将1j与Bz联合使用表现出叠加效应，表明它们具有联合治疗的潜力。总体而言，这些发现表明1j是一种有前景的TcCA靶向候选药物，其疗效接近Bz，支持进一步探索碳酸酐酶抑制作为查加斯病有效治疗策略的可能性。

引言

被忽视的热带病（NTDs）是一组主要影响低收入和中等收入国家人群的传染病，从而加剧了社会不平等，影响了全球超过10亿人[1]。尽管这些疾病对全球公共卫生造成了重大负担，但现有的治疗选择却非常有限。为应对这一挑战，世界卫生组织（WHO）于2021年发布了《2021-2030年NTDs路线图》，概述了改善控制并最终根除这些疾病的战略指南[2]。其中一项关键建议是致力于推动创新的治疗干预措施，并开发更安全、更有效、更易获得的药物制剂。这些措施对于抗击NTDs至关重要，被认为是控制这些疾病的综合策略的重要组成部分[2]、[3]。

查加斯病（CD）是由克鲁兹锥虫（Trypanosoma cruzi）引起的，亟需开发新的治疗药物。该疾病对公共卫生构成严重威胁，据估计有600万至800万人感染，约7500万人处于风险之中[4]、[5]。急性期表现为高寄生虫血症和轻微的非特异性症状，或在许多情况下无症状。如果不进行适当干预，感染会进展为慢性期，约三分之一的患者会出现严重的心脏问题，包括心律失常、进行性心力衰竭以及猝死风险增加，还会伴随胃肠道问题[6]。目前，查加斯病唯一可用的药物治疗方法是苯尼达唑（Bz）和尼福蒂莫克斯（NFX）。这两种药物虽然能在急性期取得部分疗效（60–70%），但在慢性期效果甚微。此外，它们相关的副作用常常导致患者难以坚持治疗[5]、[7]、[8]、[9]。此外，BENEFIT临床试验表明Bz无法阻止慢性查加斯心肌病的进展[10]。过去几十年评估的多种候选药物，包括泊沙康唑单药治疗[11]或与Bz联合使用[12]，以及拉夫康唑[13]和费西尼达唑[14]，均未显示出令人满意的治疗效果或耐受性。这突显了迫切需要研究T. cruzi的生物学靶点，以便开发出新的、更安全、在CD两个阶段都更有效的药物。

近期研究集中在T. cruzi的各种代谢途径上，以寻找具有杀锥虫活性的新化合物。一种有前景的方法是针对对寄生虫毒力和生存至关重要的分子途径[8]。正在研究的关键分子靶点包括：负责将唾液酸分子转移到寄生虫表面的转唾液酸酶[15]；维持细胞膜完整性的麦角甾醇生物合成途径[16]；参与寄生虫侵袭、增殖、分化和免疫逃逸的半胱氨酸蛋白酶cruzipain[17]；调节氧化应激的硫醇还原酶[18]；以及对寄生虫DNA复制和稳定性至关重要的拓扑异构酶[19]。在这种背景下，T. cruzi的碳酸酐酶（TcCA）因其参与多种代谢过程而成为了一个有前景的药物治疗靶点。这种金属酶对细胞pH值稳态至关重要，它催化CO?转化为碳酸，后者进一步分解为碳酸氢盐（HCO??）和质子[20]。碳酸酐酶（CAs）是一个庞大的酶家族，分为α-、β-、γ-、δ-、ζ-、η-、Θ-和ι-CA八个类别[21]。在T. cruzi基因组中，仅鉴定出一个属于α类的异构体（TcCA），并已对其进行克隆和表征（EC 4.2.1.1）[22]。尽管其生物学作用尚未完全阐明，但该酶在CO?水合反应中表现出高催化活性，表明其在寄生虫生存中起关键作用[22]、[23]。因此，已经探索了多种TcCA抑制剂，包括磺胺类药物、巯基化合物、羟胺类、酚类和阴离子抑制剂[24]。尽管磺胺类药物（R-SO?NH?）对前鞭毛体（epimastigotes）的效果有限[25]，但当以纳米乳液形式用于T. cruzi的Dm28c和Y菌株时显示出显著活性[26]。巯基化合物也被证明能抑制前鞭毛体的生长[22]。羟胺类化合物则表现出更广的活性谱，能影响前鞭毛体、无鞭毛体和锥鞭毛体生命周期阶段，并在鼠模型中降低寄生虫血症[27]。这些发现表明TcCA抑制剂作为可行的治疗候选药物具有潜力，因为它们的作用机制不同于现有药物，有助于解决药物耐药性和毒性的问题。在本研究中，我们评估了19种TcCA抑制剂对临床相关T. cruzi形式的生物活性，并利用稳健的细胞模型来筛选适合进一步药理开发的候选药物。

部分内容摘要

化学

关于衍生物1a-1s的合成方法和化合物表征的详细信息已在先前文献中报道[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]中提到。

体外评估TcCA抑制活性

通过使用Sx.18Mv-R Applied Photophysics（英国牛津）的停流仪器[37]，通过CO?水合反应评估了CA同工酶的催化活性。使用苯酚红（0.2 mM）作为指示剂，在557 nm处测量吸光度峰值，缓冲液为10 mM Hepes（pH 7.5），Na?SO?浓度为0.1 mM。

TcCA活性的抑制

从表1中可以得出以下结构-活性关系（SARs）。抑制剂1(a-s)显示出广泛的抑制常数（K_Is），范围为34.9–23,800 nM。需要水解的CAI前体药物1h、1i、1k和1l对TcCA的抑制作用较弱，K_Is范围从高纳摩尔到中等微摩尔，分别为865.2–16,400 nM。相比之下，基于磺胺类的双尾和三尾CAIs1s和1q表现出最强的抑制效果

结论

本研究表明，针对T. cruzi的碳酸酐酶是一种机制独特且具有治疗意义的方法。TcCA抑制剂1h和1j在2D和3D心脏感染模型中均表现出一致的抗寄生虫活性，同时保持了宿主细胞的完整性。1j的杀锥虫效果和长期抑制寄生虫复发的能力使其成为有潜力的候选药物。此外，这两种抑制剂的联合使用还表现出叠加效应

CRediT作者贡献声明

Sarah da Costa Lanera：撰写原始草稿、进行研究、进行正式分析。Leonardo da Silva Lara：撰写原始草稿、进行可视化处理、验证结果、进行研究。Lorraine Martins Rocha Orlando：验证结果、进行研究。Thamyris Pérez de Souza：进行可视化处理、进行研究。Edinaldo Castro de Oliveira：进行研究。Victoria Barbosa Paes：进行研究。Nathalia da Silva Figueiredo：进行研究。Simone Giovannuzzi：进行研究。Anna Nikitjuka：进行研究。Alessio Nocentini：

资助

本研究得到了奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会（Funda??o Oswaldo Cruz）和里约热内卢州研究资助基金会（FAPERJ）（资助编号E-26/202.409/2021、E26/201.001/2022、E-26/210.613/2023）、以及巴西国家科学技术发展委员会（Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico，CNPq）（资助编号424015/2018-8、404212/2023-9、303693/2024-0、441649/2024-6）的资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢巴西里约热内卢奥斯瓦尔多·克鲁兹研究所（Fiocruz）的生物测定和流式细胞术平台多用户研究设施、健康技术发展计划（RPT），以及巴西高等教育人员培训协调委员会（CAPES）-财政代码001的支持。同时感谢Alanderson Nogueira、Dayse Teixeira Silva Neto、Liliane Batista de Mesquita和Renata Dias de Souza Soares提供的技术支持。A.N.还感谢RRF（5.2.1.1.i.）的支持。