《International Journal of Biological Macromolecules》：A thermally triggered, in situ-forming tropoelastin hydrogel enables programmed control of stem cell–driven cartilage regeneration in osteoarthritis
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针对骨关节炎（OA）的不可逆软骨退变及现有治疗手段的局限性，本研究开发了一种基于在体成型的 tropoelastin-藻酸盐水凝胶系统，通过整合干细胞招募肽（SKP）、软骨靶向温敏颗粒（CaCl?@1-TDC/WYR）和弹性蛋白（TE）三个模块，实现“招募-锚定-分化”时空编程控制，有效提升内源性MSCs的招募效率、抗凋亡能力及软骨分化效果，在OA大鼠模型中显著改善软骨修复和力学性能。
宋宇伟|高文彦|高毅|高树涛|苗雅|周国强|王蓓|杨新健|金毅
河北大学基础医学学院，河北省炎症-自身免疫性疾病发病机制与控制重点实验室，国家新药制剂与辅料重点实验室，教育部药物化学与分子诊断重点实验室，保定市，071002，中国
摘要
骨关节炎（OA）的特点是软骨不可逆的退化，目前的疗法只能缓解症状，无法实现真正的软骨再生。基于内源性间充质干细胞（MSCs）的修复策略具有潜力，但受到招募效率低、在受损软骨上的滞留能力差、失去贴壁能力（anoikis）以及分化方向不可控等问题的限制。本文报道了一种多功能原位形成的tropoelastin-海藻酸盐水凝胶，该水凝胶能够程序化地调控内源性MSCs驱动的软骨再生。该系统整合了三个协同作用的模块：(1) 一种干细胞招募肽（SKP），用于吸引多种内源性MSCs；(2) 针对软骨的热敏颗粒（CaCl?@1-TDC/WYR），可实现精确锚定在受损软骨上并触发快速凝胶化；(3) tropoelastin（TE），可促进MSCs的增殖和软骨分化。通过关节内注射，该水凝胶能够执行“招募-锚定-分化”的程序化过程：SKP/TE促进MSCs的有效归巢，热敏颗粒确保细胞在软骨表面的稳定定位和滞留，而富含TE的基质则支持细胞的增殖和定向分化。体外实验表明，该水凝胶能够有效招募MSCs，在失去贴壁条件的情况下保持细胞存活，并增强软骨分化相关基因的表达。在OA大鼠模型中，与对照组相比，该水凝胶显著改善了软骨损伤情况，减少了骨关节炎的退化，并恢复了软骨的生物力学性能。
引言
骨关节炎（OA）是一种全球范围内普遍存在的慢性关节疾病，其特征是关节软骨的进行性和不可逆性退化，导致疼痛、功能障碍和生活质量下降[1],[2],[3],[4]。目前的治疗策略主要包括止痛药、非甾体抗炎药（NSAIDs）、关节内注射皮质类固醇/透明质酸，以及最终的关节置换手术，这些方法主要侧重于缓解症状和延缓疾病进展，而非实现组织再生[5],[6],[7],[8]。为了超越单纯的症状管理，出现了微骨折和自体软骨细胞移植（ACI）等再生性治疗方法，旨在直接修复关节软骨。然而，这些技术长期疗效有限，并面临供体部位并发症、纤维软骨形成以及与周围正常组织融合不良等问题[9],[10]。因此，开发能够实现真正软骨再生的安全有效治疗方法仍是OA治疗中的关键需求。这一持续存在的临床空白凸显了迫切需要创新策略来从根本上解决软骨修复问题。
基于干细胞的疗法，尤其是利用间充质干细胞（MSCs）的疗法，在OA软骨修复领域具有巨大潜力[11]。MSCs具有多能性、免疫调节特性，尤其是具有向炎症和损伤部位迁移的能力[12]。骨髓来源的MSCs（BMSCs）和滑膜来源的MSCs（SMSCs）因其易获取性和软骨分化潜力而成为理想的修复候选细胞[13],[14]。最近的进展集中在增强关节腔内的内源性MSCs池，通过招募策略（如使用趋化因子SDF-1或特定肽）将MSCs吸引到病变部位，从而避免外源性细胞移植的复杂性和监管障碍[15],[16]。尽管基于内源性MSCs的疗法在多项临床前和临床研究中显示出治疗效益，但仍存在显著转化限制，包括招募效率不足、在受损且通常不友好的软骨表面上的细胞滞留和植入效果差，以及容易失去贴壁能力（anoikis），这些因素可能限制治疗效果的持久性和软骨分化的效果[17],[18]。尽管具有潜力，但克服这些招募、滞留和存活的关键限制对于将其潜力转化为临床应用至关重要。
有效的递送系统和微环境控制对于实现内源性MSCs在OA软骨再生中的潜力至关重要。基于水凝胶的系统因其高水分含量、生物相容性、润滑性以及能够模拟天然软骨细胞外基质（ECM）的特性，已成为关节内治疗的核心平台[19]。它们的润滑性能可减少摩擦和磨损，缓解疼痛，同时能够控制释放治疗剂（药物、生长因子、细胞），从而带来显著优势[20],[21]。原位形成的水凝胶在生理信号（如温度、pH值、离子）的作用下在关节内发生溶胶-凝胶转变，特别具有吸引力[22]。这类水凝胶可实现微创注射，并对不规则的软骨缺损进行均匀覆盖。先前的研究包括酶交联水凝胶、多功能复合热敏水凝胶，甚至用于骨软骨修复的外源性BMSCs原位输送的水凝胶[23],[24],[25]。然而，现有的内源性MSCs治疗水凝胶策略往往较为简单：它们通常仅从单一来源（如滑膜）招募MSCs，对MSCs的行为缺乏时空控制，无法确保细胞在受损软骨上的有效植入和防止失去贴壁能力，或缺乏对软骨分化过程的精确调控。因此，实现可控、高效和持续的软骨再生仍然是一个挑战。虽然水凝胶作为递送载体具有巨大潜力，但现有系统在整合内源性干细胞的招募、植入、存活和分化的多功能和可编程控制方面存在不足，这对于实现可靠的软骨再生至关重要。
为克服这些关键限制，我们开发了一种热触发型、基于海藻酸盐的原位形成水凝胶，能够实现内源性干细胞驱动的软骨再生的程序化“招募-锚定-分化”过程。该系统在钙海藻酸盐-tropoelastin基质中整合了三个核心功能组件：(1) 一种干细胞招募肽（SKP），可主动吸引多种内源性MSCs，从而克服来源和数量的限制[26]；(2) 针对软骨的热敏颗粒（CaCl?@1-TDC/WYR），可实现精确锚定在受损软骨表面，并在温和热刺激下释放Ca2?以启动快速凝胶化[27],[28]；(3) tropoelastin（TE），与SKP协同作用，促进MSCs的持续招募和软骨分化[29]。通过这种集成设计，水凝胶依次执行三个治疗步骤：SKP/TE招募MSCs，热敏颗粒确保细胞在目标位置的稳定锚定并防止失去贴壁，富含TE的基质促进细胞增殖和软骨分化。这种“招募-锚定-分化”的可编程策略有效解决了来源限制、招募效率低、失去贴壁能力和分化方向不可控等问题，为OA中内源性干细胞介导的软骨再生提供了可靠且可转化的方案（图1）。
SA-Tropoelastin结合物的合成与表征
SA-Tropoelastin结合物是通过EDC/NHS介导的碳二亚胺化学反应合成的。具体步骤如下：在MES缓冲液（200 mM，pH 6.5）中制备2%的SA溶液。在弱光条件下，加入EDC（50 mM）和等摩尔的NHS，搅拌15分钟以激活SA上的羧基。用NaOH将溶液pH调整至7.5，然后加入TE（20 μg/mL），并在室温下反应过夜。生成的SA-TE结合物通过透析进行纯化。
为了构建一个具有精确空间控制和生物功能性的可编程水凝胶平台，我们首先对系统的每个组件进行了工程设计和性质表征，以验证其物理化学性质和功能整合性。作为TE的模型替代物，使用了牛血清白蛋白（BSA），因为其具有类似的胺基功能和光谱检测能力。
结论
本研究开发了一种多功能、原位形成的tropoelastin水凝胶，能够程序化地调控内源性MSCs在骨关节炎中的软骨再生。通过整合干细胞招募肽、针对软骨的热敏颗粒和富含tropoelastin的钙海藻酸盐基质，该系统实现了“招募-锚定-分化”的顺序过程。这一设计有效增强了从多种来源招募MSCs的能力，确保了...
宋宇伟：撰写 – 原始草稿、方法学、实验设计。
高文彦：软件开发、数据分析。
高毅：数据可视化、实验分析。
高树涛：项目监督、概念构思。
苗雅：结果验证。
周国强：项目管理。
王蓓：数据管理。
杨新健：项目管理、资金获取。
金毅：撰写 – 审稿与编辑、资金获取、概念构思。
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
本工作得到了国家自然科学基金（32471460）、河北省自然科学基金（H2025201051）、河北省政府引导的地方科技发展项目（236Z1301G）、河北省高等教育科研项目（JZX2023001）、河北大学科研创新团队（IT2023C06）以及河北省研究生创新能力培养计划的支持。
