《International Journal of Biological Macromolecules》：Pulmonary delivery of a humanized heavy-chain antibody LcrV-X19-R1 confers complete protection against fatal pneumonic plague in mice
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肺鼠疫高致残性难题获突破，本研究开发新型吸入式人源化重链抗体LcrV-X19-R1，通过靶向LcrV蛋白抑制Yersinia pestis毒力因子释放，并激活抗体依赖性细胞吞噬清除病原体，在致死小鼠模型中实现100%存活率。药代动力学显示肺抗体浓度较静脉给药提升10倍，维持超120小时，且抗体兼具热稳定性和低免疫原性，为呼吸系统传染病治疗提供新范式。
吕萌 | 王蓉 | 王曦 | 胡凌飞 | 张莉莉 | 吴晨曦 | 郭晓鹏 | 郑新怡 | 周东升 | 杨文辉 | 谢立新
中国人民解放军总医院第八医学中心肺与重症医学科，北京，100091，中国
摘要 肺鼠疫是鼠疫最致命的形式，如果不治疗，24小时内的死亡率接近100%。耐药性鼠疫耶尔森菌 株的出现对传统抗生素疗法构成了重大挑战，因为这些菌株能够人际传播。虽然治疗性抗体提供了一个有前景的替代方案，但其静脉注射受到低肺生物利用度和疗效不佳的限制。针对鼠疫耶尔森菌 III型分泌系统的关键毒力因子LcrV，我们开发了一种人源化重链抗体LcrV-X19-R1，并将其制备为吸入剂。LcrV-X19-R1对LcrV具有高亲和力（K D 为0.561 nM），表现出良好的热稳定性，在雾化后产生质量中位数空气动力学直径≤5 μm的可吸入气溶胶颗粒，并在体内显示出有利的安全性，所有这些特性均符合有效肺沉积的标准。在致命的肺鼠疫小鼠模型中，LcrV-X19-R1的肺内给药实现了100%的存活率，完全清除了器官中的细菌负荷，并显著减少了组织损伤。LcrV-X19-R1的保护机制包括在组织中直接中和细菌以及通过抗体依赖的细胞吞噬作用增强清除，这两者共同抑制了有害炎症并促进了组织修复。从药代动力学角度来看，肺内给药使肺部的抗体水平提高了约10倍，并且在120小时后仍能保持较高水平，远超过静脉注射的效果。这些优势最终使存活率提高了70%，而静脉注射的存活率为0%。本研究建立了一种针对肺鼠疫的黏膜治疗策略，并为开发针对其他呼吸道传染病的抗体基干预措施提供了一个多功能平台。
引言 鼠疫是由鼠疫耶尔森菌 （Y. pestis ）引起的一种严重传染病，在历史上三次大流行中导致超过2亿人死亡。如果不治疗，肺鼠疫形式的死亡率在症状出现后24小时内接近100% [1]，[2]。由于其极高的毒力和潜在的气溶胶传播能力，鼠疫耶尔森菌 被美国疾病控制与预防中心列为A类生物恐怖主义剂 [3]，[4]。尽管抗生素在控制大规模鼠疫暴发方面有效，但该疾病仍在非洲、亚洲和美洲的局部自然疫源地持续存在。值得注意的是，自2010年以来，马达加斯加经历了四次肺鼠疫暴发，每次都涉及耐药性鼠疫耶尔森菌 株的人际传播。同时，多个地区报告了耐药菌株，从对链霉素或多西环素等个别药物耐药到多重耐药表型 [5]，[6]。因此，肺鼠疫的再次出现和抗生素耐药菌株的持续出现促使世界卫生组织将鼠疫耶尔森菌 列入2024年优先病原体蓝图，强调了加速治疗的紧迫性 [7]，[8]。
抗菌素耐药性的日益严重增加了人们对基于抗体的疗法的兴趣，作为传统抗生素的有希望的替代品。这一趋势体现在针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 和铜绿假单胞菌 的单克隆抗体上，这些抗体已经进入了临床试验 [9]，从而激发了针对鼠疫耶尔森菌 开发类似治疗策略的积极性。在用于治疗鼠疫的主要抗体候选物中，大多数针对两个关键抗原：F1荚膜和LcrV蛋白。尽管F1特异性抗体在动物模型中显示出疗效，但其有效性可能受到天然存在的F1阴性鼠疫耶尔森菌 株的限制，这引发了关于潜在治疗失败的担忧 [10]，[11]。相反，LcrV是鼠疫耶尔森菌 III型分泌系统（T3SS）中高度保守的结构蛋白，提供了一个更可靠的治疗靶点。针对LcrV的抗体表现出强大的中和活性，并在体外和体内模型中显示出显著的保护效果，突显了其强大的转化潜力 [12]，[13]，[14]。
然而，传统IgG抗体的临床应用受到其较大分子大小（约150 kDa）、组织渗透受限和固有的免疫原性的阻碍。特别是，小鼠或嵌合抗体可能在人体内诱导抗药抗体反应，进一步降低了其治疗效果 [15]。为了解决这些问题，抗体工程专注于对来自骆驼科动物或鲨鱼的天然低免疫原性重链抗体（HCAbs）进行合理的人源化改造。这一策略促进了HCAbs及其单域衍生物（称为HCAbs的可变域VHHs，约15 kDa）的开发，与传统的IgG分子相比，这些衍生物具有更好的组织渗透性和更低的免疫原性 [16]，[17]。
除了分子设计外，给药途径对治疗效果至关重要。在肺部感染中，全身给药通常需要高剂量，但仍可能无法在肺部达到足够的药物浓度 [15]，同时增加了全身毒性的风险。相反，气溶胶化的肺部给药能够将治疗剂直接沉积到呼吸道和肺泡中，从而显著提高局部浓度并减少全身暴露和相关不良反应 [18]，[19]。这种靶向给药方法是治疗肺鼠疫的最佳策略。
此外，HCAbs和VHHs的独特结构特征决定了它们在肺部给药后的药代动力学特性。与缺乏Fc区域且能快速穿过气-血屏障的低分子量VHHs不同 [20]，HCAbs体积较大，并具有功能性Fc域。这个Fc域与肺黏膜表面的新生儿Fc受体（FcRn）相互作用，促进了长期的局部保留、增强了对抗黏液纤毛清除的抵抗力，并提高了在肺部对抗蛋白酶降解的稳定性 [20]，[21]。综上所述，这些特性使HCAbs成为吸入免疫治疗肺鼠疫的特别有前途的候选者。
基于针对LcrV的原理，我们开发了一种针对这一关键毒力因子的HCAb。通过结合双峰骆驼 免疫和噬菌体展示的方法，我们鉴定了一种特定的抗LcrV VHH。然后将该候选抗体人源化并与人类IgG Fc域融合，生成了名为LcrV-X19-R1的HCAb，其在体外表现出高效的中和活性。经过气管内气溶胶给药后，LcrV-X19-R1有效到达了小鼠肺部，并显示出良好的肺部保留和沉积。基于这些发现，我们在致命的肺鼠疫模型中评估了LcrV-X19-R1的治疗效果。抗体的肺部给药通过双重作用机制提供了强有力的保护。一方面，它直接在中和鼠疫耶尔森菌 的LcrV蛋白，从而抑制了细菌的III型分泌系统（T3SS），阻止了耶尔森菌外蛋白（Yops）注入宿主细胞。另一方面，它通过促进Fc介导的抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）增强了病原体的清除，主要涉及肺泡巨噬细胞（AMs）和中性粒细胞（Neus）。这两种机制共同引导了免疫反应的有益转变，包括有效抑制过度炎症和促进组织修复，从而协同促进了观察到的治疗结果（图1）。
材料 本研究使用的所有试剂在表S1中进行了总结。这些试剂包括蛋白质表达和纯化所需的材料、细胞和细菌培养、酶联免疫吸附测定（ELISA）、流式细胞术、免疫组化、抗体标记试剂及相关生化试剂。
重组LcrV-His的表达和纯化
编码LcrV蛋白153–477氨基酸的DNA片段（GenBank:
AAY23169.1 ）被克隆到表达载体pTIG-Trx中。该片段的核苷酸序列与
lcrV 的序列相同
LcrV-X19-R1的生成和表征 本节描述了骆驼科动物来源的VHH抗体的人源化过程以及随后选定的LcrV-X19-R1，这是一种具有高亲和力、强功能和发展潜力的完全HCAb。我们使用来自免疫文库的强效中和VHH LcrV-X19作为亲本单域抗体开始了人源化工程（图S1）。同源性建模和序列比对显示，LcrV-X19的框架区域具有最高的
讨论 本研究证明，在致命的肺鼠疫小鼠模型中，人源化重链抗体LcrV-X19-R1的肺部给药提供了完全的保护。这一概念验证了一种新的治疗策略，该策略基于吸入用工程抗体的协同优化。通过噬菌体展示、靶向人源化和Fc融合的设计过程，LcrV-X19-R1获得了最佳的分子大小、高稳定性和皮摩尔级的
结论 本研究通过分子和给药工程的集成应用，成功开发并验证了一种高效的肺鼠疫吸入抗体疗法。我们的工作不仅为肺鼠疫提供了一种非常有前景的新治疗策略，而且还概念性地展示了局部、精准免疫疗法在对抗呼吸道感染方面的巨大潜力和独特优势。这些发现因此为
CRediT作者贡献声明 吕萌： 撰写——原始草稿、方法学、研究、概念化。王蓉： 方法学、研究。王曦： 验证、形式分析。胡凌飞： 研究、数据管理。张莉莉： 研究、数据管理。吴晨曦： 形式分析。郭晓鹏： 研究。郑新怡： 撰写——审阅与编辑。周东升： 监督、资源。杨文辉： 监督、资源、方法学。谢立新： 撰写——审阅与编辑、资源、方法学，
致谢
本工作得到了国家自然科学基金 （82341119）的财政支持。
