结核分枝杆菌H37Ra中TetR家族调控因子MRA_0776对休眠相关基因dosR的调控机制及其致病性研究

《ACS Omega》：Regulation of Dormancy-Associated Genes dosR by TetR Family Regulator MRA_0776 in Mycobacterium Tuberculosis H37Ra

本研究揭示了TetR家族转录调控因子MRA_0776在结核分枝杆菌（MTB）中的多重调控角色。通过转录组学分析（RNA-seq）、电泳迁移率变动分析（EMSA）、染色质免疫沉淀PCR（ChIP-PCR）等实验，证实MRA_0776可直接且特异性结合休眠生存调控因子DosR（Rv3133c）的启动子区域，并发现一系列配体（如Arg、Lys、Tyr、Cu2+、Fe3+、Pb2+）可影响其DNA结合活性。动物实验进一步表明，过表达MRA_0776能促进耻垢分枝杆菌（Ms）在小鼠体内的定植并诱导器官病理损伤。这些发现表明MRA_0776是一个多效性调控因子，其过表达与增强的细菌定植和致病性相关，为理解结核分枝杆菌的适应性调控机制及寻找新的抗结核药物靶点提供了新视角。

　　

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）是一种导致结核病的病原体，其能够在宿主恶劣环境如低氧、酸性及营养限制条件下生存并进入潜伏状态，这是结核病反复发作和难以根除的重要原因。MTB的适应性高度依赖于其复杂的转录调控系统，其中TetR（四环素调控蛋白）家族是分枝杆菌中含量最丰富的转录调控因子家族之一。本研究聚焦于TetR家族成员MRA_0776（在MTB H37Rv中的同源蛋白为Rv0767c，在耻垢分枝杆菌Mycolicibacterium smegmatis中的同源蛋白为MSMEG_5860），探讨其在MTB H37Ra中对休眠相关基因dosR（Dormancy survival regulator, Rv3133c）的调控机制及其生理功能。

转录组学与MRA_0776靶基因分析

为了探究MRA_0776的调控网络，研究团队构建了MRA_0776过表达菌株pMV262-MRA_0776-H37Ra并进行转录组测序（RNA-seq）分析。与对照菌株pMV262-H37Ra相比，过表达MRA_0776导致234个基因的转录水平发生显著改变，其中111个基因上调，123个基因下调。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示，这些差异表达基因涉及脂肪酸代谢、甘油酯代谢、双组分系统、糖异生、三羧酸（TCA）循环、精氨酸生物合成等多个关键生理过程。基因本体（GO）富集分析进一步表明，差异基因与细胞膜组分、膜固有成分、整合膜成分以及氧化还原酶活性等功能相关。这些结果强烈提示MRA_0776是一个具有广泛调控功能的多效性调控蛋白。基于转录组数据，研究选择了20个具有显著表达变化和重要生理功能的基因进行实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）验证，结果证实了转录组数据的可靠性。

体外DNA结合实验验证及保守基序预测

为了确认MRA_0776是否直接调控其靶基因，研究从转录组数据中筛选了26个启动子区域（包含19个上调基因和7个下调基因的启动子），利用纯化的重组MRA_0776蛋白进行体外电泳迁移率变动分析（EMSA）。实验结果显示，随着MRA_0776蛋白浓度的增加，大多数被测试的启动子DNA片段均发生明显的迁移滞后，形成蛋白-DNA复合物，表明MRA_0776能够直接结合这些基因的启动子区域，进一步证实了其作为转录调控因子的直接作用。

MRA_0776在体内外特异性结合dosR启动子

鉴于dosR基因在MTB潜伏感染和生理活动中的核心作用，研究对其进行了深入分析。竞争性EMSA实验表明，加入过量的未标记“冷”探针（dosR启动子）能够成功竞争掉标记探针与MRA_0776的结合，证明了MRA_0776与dosR启动子结合的序列特异性。生物膜层干涉（BLI）技术测定了MRA_0776蛋白与生物素标记的dosR启动子DNA的结合亲和力，测得其解离常数（K_D）为2.882 × 10^–6M，证实两者在体外存在中等强度的特异性相互作用。更为关键的是，通过染色质免疫沉淀PCR（ChIP-PCR）实验，研究在MTB H37Ra活体细胞内证实了MRA_0776能够结合到dosR的启动子区域，这从体内角度确证了dosR是MRA_0776的直接靶基因。

MRA_0776的配体特异性

TetR家族调控蛋白的功能常受小分子配体调节。为探究何种分子可能影响MRA_0776的DNA结合活性，研究利用EMSA筛选了一系列小分子。结果发现，氨基酸（赖氨酸Lys、精氨酸Arg、酪氨酸Tyr）和金属离子（Cu²⁺、Fe³⁺、Pb²⁺）均能在一定浓度下抑制MRA_0776与dosR启动子的结合。这揭示了MRA_0776能够感应并响应宿主体内广泛存在的多种信号分子，从而动态调节其调控功能。

结构预测与分子对接

为了解配体与MRA_0776相互作用的分子基础，研究利用AlphaFold2预测了MRA_0776蛋白的三维结构，并通过拉氏图（Ramachandran plot）验证了预测结构的合理性。随后，使用AutoDock Vina对筛选出的配体（Arg、Lys、Tyr、Cu²⁺、Fe³⁺、Pb²⁺）与MRA_0776进行了分子对接模拟。结果显示，所有配体与蛋白的结合能均为负值，表明相互作用在能量上是有利的。对接模型进一步预测出多个关键的相互作用残基，其中Thr-125和Tyr-186与多种配体存在高频相互作用，提示它们可能是配体结合的关键位点。

MRA_0776促进MTB定植并诱导小鼠器官损伤

为评估MRA_0776在感染过程中的生理功能，研究构建了过表达MRA_0776的耻垢分枝杆菌菌株pMV262-MRA_0776-Ms，并以此感染C57BL/6小鼠。通过尾静脉注射感染后，在不同时间点检测小鼠肝脏、脾脏、肺和肾脏中的细菌载量（菌落形成单位计数，CFU）。结果显示，在感染后第4天和第7天，pMV262-MRA_0776-Ms感染组小鼠各器官的细菌负荷均显著高于对照菌株pMV262-Ms感染组。这表明在感染早期，MRA_0776的过表达促进了细菌在宿主器官内的定植。

此外，对感染后第7天的小鼠器官进行宏观和微观病理学分析。宏观观察发现，pMV262-MRA_0776-Ms感染组小鼠肝脏出血更严重，脾脏肿大，肾脏肿胀程度也更高。苏木精-伊红（H&E）染色组织病理学分析显示，该组小鼠肝脏出现多灶性坏死、细胞核固缩溶解及水样变性；肺组织可见肺泡壁粒细胞浸润、肺泡内嗜酸性粒细胞；肾脏则主要表现为肾小管上皮细胞水样变性、肿胀以及淋巴细胞和粒细胞浸润，间质血管淤血。综合表明，MRA_0776的过表达加剧了感染引起的器官病理损伤。

讨论与结论

本研究系统阐明了TetR家族调控因子MRA_0776在MTB H37Ra中的多功能调控角色。转录组学揭示了其对超过200个基因的广泛影响，涉及多种代谢和应激通路。实验证实MRA_0776可直接调控核心休眠调控因子dosR，并通过感应宿主环境中的氨基酸和金属离子来微调其DNA结合活性，这为理解MTB如何适应宿主微环境提供了新的分子机制。分子对接研究为靶向MRA_0776配体结合域的药物设计提供了潜在位点（如Thr-125）。最重要的是，动物模型实验首次将MRA_0776的调控功能与细菌体内定植能力和致病性联系起来，表明其过表达能够增强细菌的早期定植并导致更严重的器官损伤。

综上所述，MRA_0776被确立为一个多效性转录调控因子，通过直接调控dosR等关键基因，并整合多种环境信号，在MTB的适应性生存和致病过程中发挥重要作用。本研究加深了对MTB转录调控网络复杂性的理解，并为未来开发针对此类调控因子的新型抗结核疗法奠定了理论基础。需要指出的是，当前体内功能数据主要基于耻垢分枝杆菌模型获得，后续研究需在毒力MTB菌株（如H37Rv）中通过基因敲除/敲低等手段进一步验证MRA_0776的精确生理功能和治疗靶点潜力。