《ACS Omega》：Virtual Screening and MD Simulation-Driven Discovery of USP7 Inhibitors BML-284
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本文基于药物重定位（drug repurposing）、计算机辅助药物设计（CADD）及分子模拟策略，系统筛选并验证了靶向去泛素化酶USP7的高亲和力小分子抑制剂BML-284，其在体外对MYCN扩增型及非扩增型神经母细胞瘤（NB）细胞均展现出显著的抗增殖、促凋亡及抑制迁移活性，为靶向“不可成药”靶点N-Myc提供了创新且高效的间接调控方案。
神经母细胞瘤（Neuroblastoma， NB）是一种致命性儿科实体瘤，尤其高危组患者（如MYCN扩增型）的5年生存率低于50%。由于N-Myc蛋白缺乏有序结构域和小分子结合口袋，直接靶向治疗面临挑战。研究表明，去泛素化酶USP7通过直接与N-Myc互作，抑制其泛素化介导的蛋白酶体降解，从而稳定N-Myc蛋白并维持肿瘤恶性表型，使其成为间接调控N-Myc的关键替代靶点。
基于此，研究者提出了一种结合药物重定位、计算机辅助药物设计（CADD）和多尺度分子模拟的策略，以发现新型USP7抑制剂。研究首先从PDB数据库获取USP7蛋白晶体结构（PDB ID：5N9T），并整合MCE激酶抑制剂库、APExBIO抗癌化合物库、临床前及临床化合物库和L1300 FDA已批准药物库，构建了包含7322个化合物的初始数据库。
计算机辅助药物设计（CADD）用于发现潜在的USP7抑制候选化合物
在虚拟筛选中，以已知USP7抑制剂P 22077为阳性对照，采用三级筛选流程：高通量虚拟筛选（HTVS）、标准精度（SP）对接以及诱导契合柔性对接结合MM/GBSA（分子力学广义波恩表面积）结合自由能计算。经过层层筛选，最终从24个初步命中化合物中，根据MM/GBSA结合自由能排名，结合模式分析显示，候选化合物（如C6、C3、C24等）与USP7的关键结合残基Phe409、Arg408和Val296形成了稳定的氢键、π–π堆积或π-阳离子相互作用。
分子动力学（MD）模拟与伞状采样（US）模拟筛选USP7高亲和力配体
为评估结合亲和力与稳定性，研究对USP7-化合物复合物进行了5次重复的100纳秒分子动力学（MD）模拟。基于平衡期（50-100 ns）轨迹，采用MM/PBSA（分子力学泊松-玻尔兹曼表面积）方法计算结合自由能（ΔGbind）。结果显示，多个化合物（如C6、C3、C14、C20、C16、C5、C24和C15）的ΔGbind低于阳性对照P 22077（-33.57 ± 6.22 kcal/mol），被定义为USP7高亲和力配体。其中，C24（BML-284）的结合自由能为-35.36 ± 5.11 kcal/mol。
随后，通过分析配体RMSD（均方根偏差）评估复合物动态稳定性。结果显示，部分高亲和力配体（如C5、C15、C20）在某些重复模拟中表现出不稳定的配体RMSD波动，暗示其结合构象易变或易于从结合口袋中部分解离。而C6、C3、C14、C16、C24及P 22077则在所有重复模拟中均表现出优异的构象稳定性。
为定量评估结合强度，研究进一步采用牵引分子动力学（SMD）和伞状采样（US）模拟计算解离自由能（ΔG）。结果显示，USP7-C24复合物的解离自由能为33.34 kJ/mol，与阳性对照USP7-P 22077（29.53 kJ/mol）相当，表明C24与USP7形成了牢固且不易解离的结合。综合MD模拟、MM/PBSA计算、配体RMSD稳定性分析以及SMD/US模拟验证，最终将C6、C14、C16和C24确定为对USP7具有高亲和力的优选配体。
CCK-8实验筛选具有高抗NB活性的配体
在细胞水平，研究通过CCK-8细胞活力实验评估了候选化合物对不同NB细胞系的杀伤活性。在SK-N-BE(2)细胞中，C24表现出最强的杀伤活性，其IC50值最小且剂量-效应关系最可靠。为验证其广谱性，研究进一步在MYCN扩增型（IMR-32）和非扩增型（SK-N-SH， SK-N-AS， SH-SY5Y）NB细胞中测试。结果显示，C24（BML-284）对所有测试的NB细胞系均表现出优异的细胞毒性，IC50值在0.6278至1.410 μmol/L之间，显著优于其他优选化合物（C6、C14、C16）及阳性对照P 22077。
BML-284（C24）对NB细胞增殖、克隆形成及迁移的抑制作用
为深入探究BML-284的抗肿瘤表型，研究在SK-N-BE(2)和IMR-32细胞中进行了一系列功能实验。形态学观察显示，经1 μmol/L BML-284处理24小时后，两种细胞密度显著降低，形态发生明显改变。
克隆形成实验表明，BML-284处理14天后，两种细胞的集落形成能力均被显著抑制。Transwell迁移实验结果显示，BML-284处理显著降低了穿过小室膜的细胞数量，表明其能有效抑制NB细胞的迁移能力。EdU细胞增殖检测进一步证实，BML-284处理后，两种细胞中EdU阳性细胞（代表增殖细胞）的比例均显著下降，说明其能有效抑制NB细胞的增殖。
BML-284（C24）对NB细胞中USP7表达及凋亡的调控作用
机制研究表明，BML-284能够调控USP7-N-Myc信号轴并诱导细胞凋亡。免疫荧光实验显示，BML-284处理显著降低了SK-N-BE(2)和IMR-32细胞中USP7的荧光信号强度。流式细胞术（Annexin V/PI双染）分析证实，BML-284处理显著增加了两种细胞早期和晚期凋亡细胞的总比例。
Western blot分析提供了进一步的分子证据：在两种细胞中，BML-284处理均能显著下调USP7和抗凋亡蛋白BCL-2的表达水平，同时促进凋亡标志蛋白Cleaved PARP的生成（表现为Cleaved PARP-N/PARP比值升高）。这些结果共同表明，BML-284通过下调USP7表达、抑制BCL-2并促进PARP切割，有效诱导了NB细胞凋亡。
验证BML-284对USP7的靶向特异性：来自下游通路调控与直接结合的多维度证据
为确证BML-284通过特异性靶向USP7发挥抗NB作用并排除脱靶效应，研究从下游通路和直接结合两个方面进行了验证。Western blot分析显示，在SK-N-BE(2)和IMR-32细胞中，BML-284（1 μmol/L）处理与阳性对照P 22077（5 μmol/L）处理一致，均能显著下调USP7及其直接下游靶蛋白N-Myc和MDM2的表达，这间接表明BML-284可能通过靶向USP7及其下游通路发挥作用。
为进一步提供直接证据，研究采用了药物亲和力响应靶标稳定性（Drug Affinity Responsive Target Stability， DARTS）实验。其原理在于，当小分子药物与其靶蛋白特异性结合后，会稳定蛋白的空间构象，从而增强其对蛋白酶（如Pronase E）降解的抵抗能力。实验结果显示，在SK-N-BE(2)和IMR-32细胞中，与DMSO + Pronase E对照组相比，BML-284 + Pronase E处理组的USP7蛋白条带灰度值显著增加，且这种增强趋势与P 22077阳性对照组完全一致。这直接证明了BML-284能够与USP7发生特异性结合。
综上所述，本研究通过整合计算模拟与体外实验，成功发现了BML-284（C24）作为一种新型高效的USP7抑制剂。它在分子水平与USP7高亲和力、稳定结合；在细胞水平对多种NB细胞亚型展现出强大的抗增殖、抑制克隆形成与迁移、促凋亡活性；其作用机制明确，通过直接靶向USP7，调控其下游的N-Myc和MDM2蛋白表达，从而发挥抗肿瘤效应。这项研究不仅为高危神经母细胞瘤的治疗提供了一个有前景的候选药物，也为开发针对其他“间接可调控”的“不可成药”靶点的小分子抑制剂提供了一个可借鉴的技术框架。
