基于μHANABI超声平台定量解析蛋白质淀粉样纤维成核机制：连接折叠与成核途径的物理化学研究

《ACS Omega》：Quantitative Analysis of Amyloid Fibril Nucleation by Linking Folding and Nucleation Pathways Using a Robust Ultrasonic Assay

本文通过自主研发的高重现性微型超声平台（μHANABI），系统研究了内在无序蛋白α-Syn和天然折叠蛋白β2m在不同盐浓度与温度下的淀粉样纤维成核动力学。研究发现，α-Syn的成核随盐浓度单调加速，而β2m则呈U型依赖；这一差异可通过过饱和度模型与经典成核理论（CNT）解释，揭示了折叠反应与相变耦合的物理化学机制，为针对不同蛋白类型的淀粉样变疾病干预策略提供了新见解。

　　

引言

淀粉样纤维是一种由变性蛋白质通过交叉β结构形成的晶体状有序聚集体，其沉积是阿尔茨海默病、帕金森病以及透析相关淀粉样变等40余种人类淀粉样变疾病的病理标志。淀粉样纤维的形成是一个成核依赖性过程，通常始于变性蛋白质单体的过饱和溶液，类似于溶质的结晶过程。对于缺乏天然结构的固有无序蛋白质（IDPs，如α-突触核蛋白），其淀粉样形成的热力学平衡可由变性单体向淀粉样纤维的溶解度受限相变描述；而对于具有天然构象的蛋白质（如β₂微球蛋白），除了变性单体与纤维间的相变外，还需考虑天然态与变性态之间的折叠反应平衡。然而，淀粉样纤维形成动力学的定量分析，特别是在与折叠反应关联的背景下，仍有待深入研究。

材料与方法

本研究构建了名为μHANABI（micro-HANdai Amyloid Burst Inducer）的桌面型超声反应器平台，以实现高重现性、高通量的淀粉样纤维形成动力学分析。该系统采用Langevin型换能器，工作频率约为23.0 kHz，可容纳含18个样品孔（每孔体积150 μL）的圆形样品板，并通过集成的温控与荧光检测单元实现稳定的超声诱导与实时监测。使用硫黄素T（ThT）荧光染料作为淀粉样结构形成的探针，荧光激发波长450 nm，发射波长约485 nm。实验中的成核滞后时间（t_lag）定义为ThT荧光强度达到其最大强度20%的时间点。

研究使用了重组表达的α-Syn和β₂m单体蛋白，分别在含不同浓度NaCl（100-1200 mM）和20 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）的溶液中，考察了温度（37-70 °C）对成核速率的影响。通过远紫外圆二色（CD）光谱监测β₂m的热去折叠曲线，并基于两态转变模型（N ? D）计算了变性单体分数f_D及其绝对浓度。

结果与讨论

μHANABI平台的重复性评估

在μHANABI平台上对α-Syn样品进行超声诱导实验显示，所有18个孔中ThT荧光强度均呈现典型的S型增长曲线，成核滞后时间的变异系数仅为6.2%，显著低于以往文献报道（通常为10-25%）。这归因于系统轴向对称的声场设计，确保了各样品孔内超声能量的均匀导入，从而大幅提高了实验重现性。

α-Syn淀粉样形成的盐浓度与温度依赖性

α-Syn作为IDP，其淀粉样形成仅涉及变性单体向纤维的相变。实验发现，其成核滞后时间在37 °C至70 °C范围内均随盐浓度升高而单调缩短。这种现象可由NaCl的盐析效应解释：高盐浓度降低了水活度，从而降低了变性单体的溶解度，增加了过饱和度σ，最终加速了成核速率。同时，成核速率在恒定盐浓度下随温度升高而加快，这同样归因于高温下疏水水合熵减导致的变性单体溶解度下降。

β₂m淀粉样形成的盐浓度与温度依赖性

对于具有天然结构的β₂m，其淀粉样形成涉及天然态与变性态之间的折叠平衡以及变性单体向纤维的相变。实验结果显示，β₂m的成核滞后时间与盐浓度呈U型依赖关系：在55-57 °C下，700 mM NaCl条件促进成核，而1200 mM NaCl条件下几乎观察不到纤维形成2m在不同盐浓度与温度下的成核行为，呈现U型依赖">。CD谱分析证实，高盐浓度下未形成ThT阳性聚集体的样品仍保持天然构象，表明高盐稳定了天然态，减少了变性单体浓度。

基于经典成核理论（CNT）的定量分析

本研究将淀粉样形成视为变性单体的一维结晶过程，基于经典成核理论将成核速率J与过饱和度σ关联：J = J₀·exp[-16πγ³v²/3(k_BT)³(ln(1+σ))²]。对于α-Syn，总单体浓度即为[D]，σ随盐浓度增加而单调上升，解释了其成核加速现象。对于β₂m，通过拟合CD热去折叠曲线获得变性单体分数f_D，并结合经验溶解度模型[D]_c([NaCl])计算了不同盐浓度与温度下的过饱和度σ。计算结果表明，盐浓度增加既降低了变性单体的溶解度（促进成核），又通过稳定天然态而减少了变性单体浓度（抑制成核），二者的竞争效应最终导致U型依赖关系2m成核滞后时间与盐浓度、温度的关系">。

对淀粉样变疾病临床治疗的启示

研究结果表明，淀粉样成核可以通过溶解度限制相变与两态折叠反应的耦合框架统一描述。针对不同类型的致病蛋白，治疗策略应有所区别：对于IDPs（如α-Syn），可通过提高变性单体溶解度来降低过饱和度，从而延缓成核；对于天然折叠蛋白（如β₂m或转甲状腺素蛋白），稳定其天然构象以抑制去折叠、减少变性单体浓度则是更有效的策略。这为针对阿尔茨海默病、帕金森病、透析相关淀粉样变等疾病的靶向药物设计提供了物理化学理论依据。

结论

本研究开发了高重现性超声淀粉样纤维分析平台μHANABI，并利用该平台系统研究了α-Syn和β₂m的淀粉样成核动力学。研究揭示了盐浓度对不同结构类型蛋白质成核行为的差异性影响：IDPs的成核随盐浓度单调加速，而天然折叠蛋白的成核则呈U型依赖。通过将溶解度限制相变与两态折叠反应相耦合，并结合经典成核理论分析过饱和度变化，研究为理解淀粉样形成的物理化学机制提供了定量框架。该工作表明，μHANABI平台为淀粉样变疾病的机制研究与治疗策略开发提供了强有力的实验工具。