《ACS Omega》：Anti-Inflammatory Effect of Aniba rosaeodora Essential Oil-Loaded Chitosan Membrane
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本研究为ACS Omega“巴西化学：通过开放科学发展”特刊论文，报道了通过浇铸法制备了含有0.5%、2.5%和5.0% (w/w) 富含芳樟醇 (82.9%) 的亚马逊檀香木精油 (ArEO) 的壳聚糖 (CH) 膜，并评估了其作为抗炎创面敷料的潜力。研究证实CH与ArEO存在相互作用，增强了膜的热稳定性并防止精油单独降解。膜的杨氏模量 (41.84–48.00 MPa) 与皮肤弹性模量范围 (0.02–57 MPa) 相符，且具有良好的黏膜粘附性 (0.135–0.161 N)。体外抗炎模型结果显示，负载ArEO的膜能显著降低脂多糖 (LPS) 刺激的巨噬细胞中TNF-α和亚硝酸盐水平，展现出优异的抗炎活性。该研究为开发兼具良好机械性能和抗炎功能的天然来源创面敷料提供了新思路。
1. 引言
组织工程是一个融合材料科学、生物学和工程原理的多学科领域，旨在开发支持组织再生的系统。创面愈合过程包含四个不同阶段：止血、炎症、增殖和重塑。使用适当的无菌敷料对于恢复皮肤的再生特性、作为抵御外界环境的保护屏障至关重要。理想的创面敷料应保持湿润、促进气体交换、吸收渗出液、支持细胞生长并防止细菌感染。壳聚糖 (CH) 等多糖基化合物因其生物降解性、生物相容性、优异的生物活性物质递送能力和成本效益，成为制备膜的流行材料。壳聚糖具有促进凝血、调节炎症细胞活性、抗菌、抗氧化和止血等特性。
天然植物衍生物在开发创新的皮肤创面局部治疗方法方面日益受到关注。精油 (EOs) 是挥发性芳香物质，具有抗氧化和抗菌特性，并表现出抗病毒、杀虫、镇痛和抗炎作用，可促进创面更快愈合。亚马逊檀香木 (Aniba rosaeodora Ducke) 精油 (ArEO) 富含芳樟醇 (约85–90%)，具有抗抑郁、麻醉、抗菌、抗炎等多种生物活性。将精油掺入聚合物膜中旨在克服其挥发性和低稳定性等问题，同时增强其抗菌、屏障和机械性能。因此，本研究旨在评估富含芳樟醇的亚马逊檀香木精油掺入壳聚糖基膜的影响，并比较其在生物医学领域应用的化学、热学、形态学、机械和抗炎特性。该工作通过提出一种新型生物活性膜，为利用亚马逊生物多样性进行生物医学应用提供了原创性贡献。
2. 材料与方法
2.1. 植物材料与精油提取
檀香木 (Aniba rosaeodora Ducke) 叶片在亚马逊联邦农村大学 (UFRA) 校园采集，经气相色谱-质谱 (GC-MS) 分析，其主要成分为芳樟醇 (82.9%) 和顺式-氧化芳樟醇 (2.9%)。
2.2. 膜制备
采用浇铸法制备膜。将1% (w/v) 壳聚糖溶解于乙酸中，搅拌24小时。随后逐步加入ArEO至终浓度分别为0.5%、2.5%和5.0% (w/w)，继续搅拌30分钟。将溶液倒入平模，于40°C循环空气烘箱中干燥24小时。膜厚度为0.24 ± 0.016 mm。
2.3. 膜表征
2.3.1. 扫描电子显微镜 (SEM)
使用扫描电子显微镜对膜表面形态进行分析，样品在10 μm和100 μm放大倍数下观察。
2.3.2. 热重分析 (TGA)
使用热重分析仪在氮气氛围下，以10°C·min–1的速率从25°C加热至500°C，分析样品质量损失。
2.3.3. 傅里叶变换红外光谱 (FTIR)
使用配备衰减全反射 (ATR) 附件的FTIR光谱仪，在4000–400 cm–1范围内收集光谱，分辨率为2 cm–1。
2.3.4. 机械性能
使用质构分析仪，遵循ASTM D882–02标准进行拉伸测试，测定断裂力、伸长率、断裂应力、变形和杨氏模量。使用8% (m/v) 黏蛋白溶液评估黏膜粘附力。
2.4. 生物学测试
2.4.1. 细胞活力分析
使用MTT法评估ArEO及其负载膜对RAW 264.7小鼠巨噬细胞系的细胞毒性。细胞用不同浓度样品处理24小时后，检测其在570 nm处的吸光度。
2.4.2. 体外抗炎活性
基于MTT结果选择不影响细胞活力的三个ArEO浓度进行抗炎实验。用脂多糖 (LPS, 0.5 μg·mL–1) 刺激巨噬细胞2小时诱导炎症，随后用选定浓度的ArEO或膜样品处理24小时。地塞米松 (10 μM) 作为阳性对照。收集培养上清液进行分析。
2.4.2.1. 亚硝酸盐测定
采用Griess反应测定上清液中的亚硝酸盐水平，在540 nm波长下测量吸光度。
2.4.2.2. 肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 测量
使用商业ELISA试剂盒测定上清液中TNF-α的浓度。
2.4.3. 统计分析
使用GraphPad Prism 8.0软件，采用单因素方差分析 (ANOVA) 和Tukey多重比较检验进行数据分析，显著性水平设为p < 0.05。
3. 结果与讨论
3.1. 膜表征
3.1.1. 扫描电子显微镜 (SEM)
SEM显微照片显示所有膜表面平坦、致密且结构紧凑。ArEO的浓度不影响样品的形态，未观察到表面孔隙，这可能是由于ArEO在壳聚糖基质中潜在的挥发所致。致密的膜表面可作为有效屏障，阻止微生物进入创面并繁殖。
3.1.2. 热重分析 (TGA)
ArEO的TGA热谱图显示其在一个阶段分解，主要成分芳樟醇在174.35°C前分解挥发。含ArEO与不含ArEO的壳聚糖膜均经历三个阶段降解。ArEO的有效掺入很可能与油成分的功能基团和聚合物基质的氨基 (-NH2) 及羟基 (-OH) 之间的分子间相互作用有关，这促进了氢键形成，提供了优异的保护效果并防止了ArEO的单独分解。这表明ArEO在壳聚糖基质内保持稳定，不易在典型储存条件下挥发或降解。掺入高达5.0%的ArEO并未改变膜的热稳定性，降解起始点和主要质量损失事件与纯壳聚糖相比基本保持不变。
3.1.3. 傅里叶变换红外光谱 (FTIR)
壳聚糖膜的FTIR光谱在3676–3002 cm–1范围内显示一个宽吸收带，归属于O-H伸缩振动，并与N-H振动重叠。ArEO的掺入导致光谱出现微小变化。在1252 cm–1处观察到一个独特的吸收带，归属于C-O键的轴向伸缩，这可能与ArEO主要成分芳樟醇的存在有关。除了这一点，在负载ArEO的壳聚糖膜的FTIR光谱中未观察到新谱带的显著出现或现有峰的明显位移。这些结果表明壳聚糖与ArEO之间发生了分子间氢键相互作用，这可能有助于减少精油的过早释放，从而在创面愈合过程中保持掺入膜的生物活性。
3.1.4. 机械性能
膜的机械性能（断裂力、伸长率、断裂应力、变形和杨氏模量）及黏膜粘附力如表2所示。结果表明，掺入ArEO倾向于增加断裂伸长率，表明ArEO可能提高膜的延展性和柔韧性。杨氏模量在掺入ArEO后没有显著差异 (p < 0.05)。CH和CH/ArEO膜样品的杨氏弹性模量范围为41.84至48.00 MPa，处于皮肤弹性模量范围 (0.02至57 MPa) 内。掺入ArEO并未导致壳聚糖基膜的黏膜粘附性能发生统计学上的显著变化。黏膜粘附特性与配方中壳聚糖的加入有关，因为它延长了膜在黏蛋白盘上的停留时间。壳聚糖的黏膜粘附行为主要归因于其带正电荷的氨基与黏蛋白上带负电荷位点之间的静电相互作用。
3.2. 生物学测试
3.2.1. 细胞活力分析
单独使用的亚马逊檀香木精油 (ArEO) 在所有测试浓度下均表现出细胞毒性效应。因此，选择低于7.81 μg/mL的浓度用于后续实验。将ArEO掺入壳聚糖 (CH) 后，在所有测试浓度下，与单独的CH相比，细胞活力没有发生显著改变。
3.2.2. 体外抗炎活性
3.2.2.1. 亚硝酸盐测定
亚硝酸盐水平分析证实了在RAW 264.7巨噬细胞中成功诱导了炎症模型。地塞米松 (阳性对照) 显著降低了亚硝酸盐水平。单独使用ArEO处理在任何测试浓度下，其亚硝酸盐浓度与LPS组相比均无显著差异。然而，将ArEO掺入壳聚糖基质后，在所有评估浓度 (0.5%、2.5%和5%) 下，与LPS刺激组相比，亚硝酸盐浓度均出现统计学上的显著降低 (p < 0.0001)。此外，与LPS + CH组相比，在最高测试浓度 (5%) 下，亚硝酸盐水平显著升高 (p < 0.01)，表明增加掺入CH中的ArEO浓度可能会减弱其抗炎效果。
3.2.2.2. 肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 测量
LPS刺激后，RAW 264.7巨噬细胞中的TNF-α水平显著升高。地塞米松处理导致TNF-α产生显著减少。在所有测试浓度的ArEO下，与LPS组相比，TNF-α水平均显著降低 (p < 0.05)。类似地，用CH/ArEO处理在所有测试浓度下均降低了TNF-α水平。LPS + CH组的TNF-α水平低于LPS组，但高于LPS + DEXA组，这证实了聚合物本身的抗炎潜力。然而，仅在使用含有2.5% ArEO掺入壳聚糖基质的配方时，观察到相对于LPS + CH组的TNF-α水平进一步降低。
在本研究中，ArEO处理显著降低了TNF-α水平，但未改变亚硝酸盐浓度。这种分离表明该化合物可能选择性地调节上游信号通路，特别是那些涉及细胞因子（如TNF-α）产生的通路，而不直接影响诱导型一氧化氮合酶 (iNOS) 表达或一氧化氮 (NO) 产生。此外，本研究结果表明，用壳聚糖和亚马逊檀香木精油 (CH/ArEO) 处理可降低亚硝酸盐和TNF-α水平。这些结果强调了壳聚糖的多功能性质。萜类化合物通过抑制酶和调节免疫系统来减轻炎症。芳樟醇具有强大的抗氧化特性，有助于中和自由基并保护细胞免受氧化应激，这可能通过减少促炎细胞因子和其他炎症标志物的产生来提供保护。此外，芳樟醇可以减轻炎症、缓解痛觉过敏并提供止痛效果。因此，将壳聚糖与富含芳樟醇的亚马逊檀香木精油结合可能进一步有助于减轻炎症并促进创面愈合。
与传统的抗炎疗法（如皮质类固醇和非甾体抗炎药）相比，CH/ArEO膜提供了一种更安全、更局部的替代方案。该系统可将天然生物活性化合物持续递送至创面部位，在不影响细胞活力的情况下显著降低亚硝酸盐和TNF-α水平。这种基于生物材料的局部方法不仅实现了与传统药物相当的抗炎功效，还通过结合壳聚糖和ArEO中存在的生物活性萜类化合物的抗氧化和生物粘附特性支持组织修复。因此，CH/ArEO膜代表了一种有前景的自然策略，将炎症控制与增强的创面愈合潜力相结合。
4. 结论
开发结合亚马逊檀香木精油的壳聚糖膜用于创面愈合代表了一项有前景的进展。这些膜具有柔韧性、均匀性和连续结构，有利于其与受刺激创面部位的相互作用。它们的黏膜粘附特性确保了强大的组织粘附力，且在添加精油后未观察到显著差异。亚马逊檀香木精油在体外炎症模型中能显著降低亚硝酸盐水平，尤其是在掺入壳聚糖后。此外，在使用含有0.5%、2.5%和5%精油的膜后，LPS刺激的巨噬细胞中TNF-α水平显著降低。这些结果凸显了利用亚马逊檀香木精油与壳聚糖结合来制造先进敷料以有效解决传统创面敷料局限性的潜力。需要强调的是，为了最大化该膜用于所提出应用的能力，还需要进行更多关于化合物迁移及其与生物组织相互作用机制的测试，以及体内和人体应用测试。
