固定化真菌果糖基转移酶于硅胶及戊二醛功能化硅胶：提升果寡糖生物催化生产的稳定性与可重用性策略

《ACS Omega》：Immobilization of a Fungal Fructosyltransferase onto Silica Gel and Glutaraldehyde-Functionalized Silica Gel for Biocatalytic Applications

本研究针对可溶性果糖基转移酶（FTase）在生产高附加值果寡糖（FOS）过程中存在的稳定性低、成本高、难以回收再利用等问题，创新性地采用硅胶（SG）及其戊二醛（GLU）功能化材料（GLU-SG）作为固定化载体，对米曲霉（Aspergillus oryzae）IPT-301菌株分泌的胞外FTase进行固定化。研究系统评估了两种固定化生物催化剂（SG-FTase和GLU-SG-FTase）的理化特性、动力学行为、热稳定性、pH稳定性、储存稳定性及操作稳定性。结果表明，尽管GLU功能化使载体比表面积有所降低，并导致回收酶活性（RA）略降，但显著提高了固定化产率（IY），并通过共价键合极大增强了生物催化剂的热稳定性、抗pH变化能力、储存稳定性以及在连续批次反应中的可重用性。本研究为开发高性能、高稳定性的FOS生产用非均相生物催化剂提供了新思路，具有重要的工业应用潜力。

　　

引言背景

果寡糖（Fructooligosaccharides, FOS）作为高附加值功能性低聚糖，其全球市场价值巨大且增长迅速。工业生产FOS主要通过蔗糖的转果糖基化反应实现，该反应由微生物来源的果糖基转移酶（Fructosyltransferase, FTase, E.C.2.4.1.9）催化。然而，可溶性FTase在应用过程中存在稳定性差、难以回收、生产成本高等瓶颈。酶固定化技术是解决这些问题的关键策略，旨在获得活性高、稳定性好、可重复使用的非均相生物催化剂。在各种固定化载体中，硅胶（Silica Gel, SG）因其来源丰富、成本低廉、机械强度高、热化学稳定性好及高比表面积等优点而备受关注。通过对硅胶表面进行功能化修饰，如引入戊二醛（Glutaraldehyde, GLU），可以进一步增强酶与载体之间的结合强度，提高生物催化剂的稳定性和抗逆性。本研究首次报道了将米曲霉（Aspergillus oryzae）IPT-301的胞外FTase固定于硅胶及戊二醛功能化硅胶上，旨在开发适用于FOS生产的高性能生物催化剂。

材料与方法

载体处理与功能化：硅胶颗粒经乙醇洗涤后，一部分用25%戊二醛溶液在pH 5.5的缓冲液中活化，形成戊二醛功能化硅胶（GLU-SG）。

酶生产与固定化：使用米曲霉IPT-301发酵生产胞外FTase，将含有酶的发酵滤液分别与纯硅胶和GLU-SG在35°C下孵育6小时，通过物理吸附和共价结合实现固定化，并计算固定化产率（IY）和回收活性（RA）。

载体与生物催化剂表征：采用扫描电子显微镜（SEM）观察载体形貌，氮气物理吸附法（BET/BJH）测定比表面积、孔径和孔体积，傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析化学键和结构特征。

酶活与动力学分析：在50°C、pH 5.5条件下，测定不同蔗糖浓度下固定化FTase的转果糖基化活性（A_T），并利用Hill模型拟合数据获取最大反应速率（V_max）、表观解离常数（K_0.5）和Hill系数（n）等动力学参数。

稳定性评估：

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  热稳定性：在30-60°C温度范围内孵育生物催化剂，利用Sadana和Henley模型计算一级热失活常数（k_D）、半衰期（t_1/2），并通过阿伦尼乌斯方程计算变性活化能（E_D）及其他热力学参数（ΔH_D, ΔG_D, ΔS_D）。
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  pH稳定性：将生物催化剂在不同pH（4.5-6.5）缓冲液中4°C下孵育24小时后测定剩余活性。
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  储存稳定性：在pH 5.5、4°C条件下储存4天，每日监测酶活。
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  操作稳定性：在批次反应器中进行连续8个循环（每循环1小时）的反应，评估酶活保留情况。

结果与讨论

载体与生物催化剂表征：SEM显示硅胶颗粒表面粗糙，有利于酶吸附。BET分析表明，功能化后硅胶的比表面积和孔体积下降，这可能是戊二醛分子部分覆盖或堵塞孔道所致，但孔径仍属介孔范围（~59 ?）。FTIR谱图证实了固定化后酶蛋白特征基团（如酰胺带）的存在，以及硅胶表面Si-O-Si键的结构，表明了酶的成功固定。

固定化参数：戊二醛功能化硅胶（GLU-SG）的固定化产率（IY，39.25%）显著高于纯硅胶（SG，12.33%），这得益于戊二醛作为间隔臂与酶氨基酸残基形成共价键（希夫碱键）。然而，GLU-SG的回收酶活性（RA，6.76%）低于SG（9.67%），可能与共价键合引起的酶构象变化、活性位点修饰或传质限制有关。

底物影响与动力学：两种固定化FTase均在蔗糖浓度470 g L^-1时达到最高活性。浓度过高（>500 g L^-1）会导致底物抑制。动力学拟合显示Hill系数n>1，表明酶与底物间存在正协同效应。GLU-SG固定化酶的K_0.5值（129 g L^-1）低于SG固定化酶（186 g L^-1），表明共价固定可能略微降低了酶对底物的表观亲和力。

热稳定性：GLU-SG固定化FTase在所有测试温度下都表现出比SG固定化酶更优的热稳定性。例如，在30°C孵育16小时后，GLU-SG酶保留>70%活性，而SG酶仅保留20%。热力学参数分析进一步证实了这一点：GLU-SG固定化酶具有更长的半衰期（t_1/2）、更高的变性活化能（E_D）和变性焓（ΔH_D），表明其热变性需要更多能量，稳定性更高。所有情况下吉布斯自由能变（ΔG_D）为正，熵变（ΔS_D）为负，说明变性是非自发过程，且固定化使酶构象更有序、更稳定。

pH与储存稳定性：在pH 5.5-6.5范围内，两种固定化酶均保持较高活性，且GLU-SG酶稳定性更佳，尤其是在酸性pH下。经过4天4°C储存后，GLU-SG固定化酶残留活性（6%）是SG固定化酶（1.5%）的四倍，显示了戊二醛功能化对延长生物催化剂货架期的积极效果。

操作稳定性：在连续8个批次反应中，GLU-SG固定化FTase展现了更好的可重用性，第8个循环后仍保留约50%的初始活性，而SG固定化酶仅保留约30%。这归因于共价键合比物理吸附（范德华力、氢键、静电作用）能更有效地防止酶从载体上脱落或失活。

结论

本研究成功将米曲霉来源的胞外FTase固定于硅胶及戊二醛功能化硅胶上。尽管功能化导致酶回收活性略有下降，但它显著提高了固定化效率，并赋予生物催化剂卓越的热稳定性、pH稳定性、储存稳定性和操作可重用性。共价固定策略通过形成稳定的酶-载体连接，有效缓解了酶在不利环境下的失活和脱落问题。研究结果表明，戊二醛功能化硅胶是一种极具潜力的FTase固定化载体，为开发适用于工业化规模、经济可行的FOS生物催化生产工艺提供了重要的技术基础和理论依据。