《ACS Nanoscience Au》：Decoupling Physisorption from Chemisorption in Clickable Lipid Nanoparticles
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本综述系统揭示了在脂质纳米颗粒(LNP)抗体靶向连接中，使用流行的点击化学反应(如DBCO-叠氮化物)时，疏水性DBCO接头与LNP表面之间显著的非特异性物理吸附现象。研究发现，这种物理吸附会严重高估色谱法测得的共价连接效率，并导致体内靶向失效。文章通过对比疏水性较低的BCN接头及血浆孵育实验，验证了疏水性是主要驱动因素，并强调了严格区分物理吸附(Physisorption) 与化学吸附(Chemisorption) 对于开发可重复、高效靶向LNP疗法的至关重要性。
抗体-LNP偶联中的点击化学陷阱：疏水性驱动的非特异性物理吸附
抗体偶联对于实现脂质纳米颗粒(LNP)的靶向递送至关重要，但本研究揭示，点击化学可能会产生人为假象，干扰对抗体-LNP共价键合的准确测量。研究发现，最常用的点击化学炔烃接头——二苯并环辛炔(DBCO)——与LNP固有的疏水表面之间的疏水相互作用，会驱动广泛的非特异性抗体物理吸附，即使LNP上不存在叠氮基团。这种物理吸附会导致色谱方法测量出人为偏高的表观偶联效率。相比之下，疏水性较低的脂质体则表现出叠氮依赖性的偶联，突显了纳米颗粒表面化学的影响。
靶向LNP的背景与挑战
靶向脂质纳米颗粒是下一代核酸疗法的核心，能够实现肝外细胞类型特异性递送。尽管前景广阔，但靶向LNP的更广泛转化仍受限于在LNP表面实现可重复、高效率的靶向配体偶联这一瓶颈。共价连接抗体是实现LNP受体特异性靶向的最有效策略之一。在各种偶联化学方法中，无铜点击化学，特别是叠氮化物与炔烃DBCO之间的张力促进叠氮-炔环加成(SPAAC)反应，因其高效率、生物相容性和在温和条件下的易操作性而广受欢迎。
偶联效率测量的意外偏差与假设
对于靶向纳米载体，抗体偶联的价数（每个颗粒上的抗体数量）对决定结合亲和力与靶向性能至关重要。因此，可靠的纯化和定量分析对于准确评估靶向系统必不可少。色谱法是分离未结合抗体与偶联纳米颗粒的有效方法。然而，当将基于脂质体的偶联策略转移到LNP时，观察到了一个意想不到的偏差：即使LNP上缺乏叠氮官能团，偶联效率仍然显得很高。研究假设，这种差异源于DBCO与LNP表面之间的非特异性疏水相互作用，导致了物理吸附而非化学吸附。物理吸附(Physisorption) 指的是分子通过疏水作用或范德华力进行的可逆、非共价性粘附，而化学吸附(Chemisorption) 则涉及共价键的形成，即点击偶联的预期结果。物理吸附抗体的存在不仅会导致偶联效率的定量不准确，还会使抗体-LNP偶联物在血浆包被后不稳定，导致体内仅发生短暂结合并降低组织靶向性。
疏水性是驱动非特异性结合的关键变量
为了探究疏水性在非特异性物理吸附中的作用，研究比较了用高度疏水的DBCO和疏水性较低的类似物BCN修饰的抗体。研究发现，即使每个抗体上只有一个DBCO基团(D1 IgG)，也能产生约55%的表观偶联，并且LNP尺寸随之增加，这与更高DBCO修饰(D5 IgG)的效果难以区分。这种高结合率与叠氮的存在与否无关。相比之下，BCN修饰的抗体则表现出叠氮依赖性的结合。随着BCN:IgG比例的增加，与叠氮-LNP反应的偶联效率提高，而与无叠氮LNP的相互作用在达到B20密度之前一直不显著。这些发现支持了以下假设：疏水性DBCO接头与LNP表面强烈相互作用，驱动了非特异性物理吸附，仅靠尺寸排阻色谱(SEC)无法将其与共价点击偶联区分开来，但可以通过使用疏水性较低的BCN接头来减轻。
为了确定纳米颗粒表面的疏水性是否促进非特异性抗体结合，研究使用传统脂质体进行了平行实验。尽管表面聚乙二醇(PEG)密度相似，但LNP显示出叠氮非依赖性的抗体结合，而脂质体则没有。抗体与脂质体的结合具有强烈的叠氮依赖性。研究表明，LNP与脂质体之间的差异源于表面疏水性的不同。通过计算所有脂质组分的复合对数P值(cLogP)以及使用亲水性玫瑰红与疏水性尼罗蓝染料的染料分配实验进行验证，均证实LNP表面比脂质体更疏水。此外，非特异性结合与纳米颗粒的可电离脂质种类（如SM-102、4A3-SC8、ALC-0315和DLin-MC3-DMA）以及被DBCO修饰的蛋白质种类（如小鼠血清白蛋白MSA）无关。这些结果共同支持了非特异性物理吸附是由于LNP与DBCO之间的疏水相互作用，而非偶联蛋白或脂质配方所致。
血浆暴露区分物理吸附与化学吸附
接下来，研究探讨了D5 IgG与LNP之间的物理吸附相互作用在血浆中是否会持续存在。假设当暴露于血浆时，物理吸附的抗体会从LNP表面解离。实验将1.5%或0%叠氮-LNP与放射性标记的D5 IgG孵育，并在37°C下暴露于人血浆30分钟后再进行洗脱。洗脱曲线表明，暴露于血浆会导致D5 IgG从无叠氮LNP上大量解离，而叠氮-LNP中的大多数D5 IgG则在LNP组分中洗脱，表明化学吸附在血浆孵育过程中是稳定的。量化显示，无叠氮LNP的D5 IgG结合率从血浆前的约85%显著下降到血浆后的约40%。叠氮-LNP在血浆暴露后D5 IgG结合率也显著下降，但程度较轻，从约85%降至约70%。
为了进一步评估血浆对物理吸附的影响，研究将叠氮或无叠氮LNP与Alexa Fluor 488标记的D5 IgG在37°C的人血浆中孵育，并通过荧光纳米颗粒跟踪分析(NTA)监测混合物。荧光NTA通过跟踪可被荧光信号检测到的纳米颗粒的布朗运动，测量了抗体结合纳米颗粒的尺寸、浓度和荧光强度。假设一旦在血浆中孵育并暴露于NTA的流动条件，0%叠氮-LNP表面的D5 IgG会从颗粒上解离，而化学吸附在叠氮-LNP上的D5 IgG则保持结合。因此，通过荧光NTA测量的无叠氮LNP的表观尺寸、荧光强度和浓度应随时间下降。在30分钟终点时，NTA揭示了两种配方之间的显著差异。0%叠氮LNP表现出归一化荧光强度的显著降低，反映了表面结合抗体的丢失，而叠氮-LNP的荧光几乎保持恒定。与这些终点结果一致，可荧光检测的叠氮-LNP浓度在整个30分钟分析中保持稳定，而非叠氮-LNP的浓度则显著下降。这些数据共同表明，弱吸附的抗体会在生理条件下被置换，这强调了将血浆孵育实验作为区分抗体-纳米颗粒偶联物中化学吸附与非特异性吸附的关键质量控制步骤的必要性。
化学吸附是实现有效体内靶向的关键
为了确定物理吸附的抗体是否影响体内的主动靶向，研究使用与抗血小板内皮细胞粘附分子-1(PECAM)单克隆抗体(mAbs)偶联的0%叠氮和0.75%叠氮-LNP进行了生物分布研究。PECAM是一种跨膜糖蛋白，在内皮细胞表面大量表达，尤其是在肺微血管中。先前的研究表明，将αPECAM抗体偶联到LNP可以有效地将LNP递送从肝脏重定向到肺部。在本研究中，小鼠静脉注射了与αPECAM mAbs（约50个mAbs/颗粒）混合过夜的等效剂量的叠氮或无叠氮LNP。为了独立于抗体靶向来追踪纳米颗粒的生物分布，每种配方还含有少量放射性标记的非靶向IgG（约5个/颗粒，用Na125I标记）。
使用这种设计，研究发现αPECAM叠氮-LNP比αPECAM非叠氮LNP表现出显著更高的肺部积累。相比之下，αPECAM非叠氮LNP主要定位于肝脏和脾脏，并且显示出明显更高的血液残留，这与抗体从纳米颗粒表面解离并随后留在循环中一致。因此，αPECAM叠氮-LNP的肺定位比率（肺%ID/g除以全血%ID/g进行归一化）比αPECAM非叠氮LNP高约35倍。这些发现证实，在体内，DBCO修饰的抗体与0%叠氮-LNP表面之间的非共价物理吸附不足以介导稳定的靶向，而αPECAM与叠氮-LNP的共价化学吸附则能有效地将LNP生物分布重定向到肺部。
研究进一步使用流式细胞术探究了叠氮和非叠氮LNP的mRNA表达。对于这些流式研究，用含有Cre重组酶mRNA的αPECAM 0%叠氮或0.75%叠氮-LNP处理Ai6小鼠（该小鼠在Cre介导的STOP盒重组后表达增强型绿色荧光蛋白eGFP）。处理后24小时，将小鼠的肺、肝和脾处理成单细胞悬液，然后用针对免疫细胞、单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞和上皮细胞的抗体进行染色。通过分析器官中eGFP表达细胞的百分比（表示被Cre mRNA转染的细胞百分比），αPECAM叠氮-LNP处理组小鼠的肺部eGFP阳性细胞百分比显著高于0%叠氮-LNP处理组。相反，αPECAM 0%叠氮-LNP处理小鼠中大多数eGFP阳性细胞位于肝脏和脾脏，对应于纳米颗粒的非特异性清除而非靶向递送。进一步按细胞类型细分表达，αPECAM叠氮-LNP处理小鼠肺部的eGFP阳性内皮细胞百分比显著高于非叠氮组，这再次证实只有叠氮依赖性的αPECAM mAbs化学吸附才能驱动内皮特异性转染。总之，这些结果证实，抗体的共价连接是实现功能性、细胞特异性mRNA体内递送和表达所必需的，而非共价物理吸附则无法实现有意义的靶向。
研究意义与展望
本研究系统性地检验了使用无铜点击化学的抗体-LNP偶联，并揭示了这种被广泛采用的生物偶联方法中一个重要且此前被忽视的人为假象：即使缺乏叠氮官能团，DBCO修饰的抗体仍与LNP表现出显著的非特异性结合。这种现象源于DBCO接头与固有的疏水LNP表面之间的疏水相互作用，导致物理吸附而非通过共价点击反应实现的真正化学吸附。
这些发现对靶向纳米医学领域具有广泛意义。首先，它们揭示了传统的色谱纯化方法本身可能会导致系统性地高估偶联效率，尤其是在使用DBCO等疏水接头时。由于表观偶联效率随着DBCO修饰程度的增加而提高，这是由于疏水相互作用的增强而非化学偶联的增加，因此仅依赖色谱分离的研究可能会误解偶联产率和靶向性能。其次，这项工作为抗体-LNP偶联效率的定量和可重复评估提供了一个标准化框架。这种标准化不仅对学术可重复性至关重要，对于工业和监管转化也同样关键，因为一致的抗体表面密度和共价稳定性是产品质量控制和最终监管批准的关键参数。因此，我们的发现弥补了研究规模优化与制造水平可重复性之间的重要差距。
当然，也应承认本研究的几个局限性。DBCO与BCN之间的机制比较仅限于选定的实验条件，未来的研究可以系统量化不同抗体同种型和LNP配方中接头疏水性、纳米颗粒组成和非特异性结合之间的关系。未来的工作也将受益于纳入更先进的体内原位模型，以更好地模拟和评估叠氮与非叠氮LNP在循环中的行为。同样，抗体在纳米颗粒表面的取向未直接评估，并且可能根据相互作用的性质而有所不同，这也可能导致靶向性能的差异。此外，当前工作仅关注叠氮-DBCO点击化学，因为其在许多靶向药物递送应用中被广泛使用。然而，其他偶联化学，如四嗪-TCO或硫醇-马来酰亚胺，也可能表现出非特异性相互作用，值得在未来工作中进一步研究。最后，尽管血浆预孵育在我们的体系中有效减少了非特异性吸附，但该策略对于不同生物基质或大规模制造工作流程的普适性仍有待充分评估。
总体而言，本研究强调了抗体-LNP偶联中一个关键但此前未被充分认识的因素：疏水相互作用对表观偶联效率的影响。通过识别并解决这一混淆变量，我们为更准确、可重复且符合监管要求的靶向LNP治疗剂设计奠定了基础。
