《ACS Nano Medicine》：Engineering Optimized EV-Mimetic Carriers for Efficient Tumor-Targeted Delivery of Functional RNA Nanoparticles
引言
RNA干扰（RNAi）是一种通过功能性地使靶标信使RNA失活或降解，从而实现转录后基因沉默的强大治疗策略。近年来，多种基于RNAi的药物已获得监管批准，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变、急性间歇性卟啉病、1型高草酸尿症和高胆固醇血症等疾病，并且还有许多其他药物正处于临床前和临床开发阶段，用于治疗包括癌症在内的多种疾病。除了这些进展，基于信使RNA的COVID-19疫苗的成功也提升了人们对RNA疗法的接受度，并凸显了其广泛的临床应用潜力。在肿瘤学领域，RNAi已被研究用作一线或二线疗法，通常作为辅助手段来抑制与肿瘤进展和耐药性相关的基因。
克服肿瘤耐药性的一个主要挑战在于其多因素性质，这通常是由多基因和多通路的失调表达所驱动的。在此背景下，核酸纳米颗粒（NANPs）作为下一代RNAi平台的发展展现出了一大优势，因为它们可以被设计成在单一、明确的架构中携带多种RNAi诱导剂，从而实现多靶点组合基因沉默。NANPs可以设计成不同形状，并且根据核酸组成和维度，它们可以避免或刺激先天免疫信号通路，从而增强抗肿瘤免疫反应并改善治疗效果。尽管有这些前景广阔的特性，但其临床转化仍受到有效递送系统需求的挑战，该系统需要能够保护治疗载荷不被核酸酶降解，同时实现选择性组织摄取并最大限度地减少脱靶效应。病毒载体和脂质纳米颗粒（LNPs）已被用作RNA治疗载体，但它们的临床应用也受到不可控的免疫原性、安全性问题、受限的内涵体逃逸和组织趋向性的限制。
作为一种替代方案，细胞外囊泡（EVs）因其卓越的生物相容性、低免疫原性和天然趋向性而成为极具吸引力的载体。它们是几乎所有细胞类型分泌的纳米级脂质双层囊泡，携带多种生物分子（如蛋白质、脂质和核酸），并在细胞间通讯中发挥关键作用。多项研究表明，无论是在体外还是体内，EVs在摄取和递送效率方面都优于传统的脂质体和病毒系统。此外，近期一项使用装载了靶向KRASG12D小干扰RNA的EVs治疗胰腺癌的I期临床试验，证明了基于EV的RNA递送在人体中的可行性和安全性，进一步支持了其治疗潜力。然而，其更广泛的临床转化仍然受到制造挑战的限制，包括标准分离方法的低产量、导致批次间差异的生物异质性，以及普遍较低的载荷装载效率。为了克服其中的一些限制，合成EV模拟物（EVMs）被提出作为替代方案，以重现天然EVs的功能特性，同时允许控制成分和可扩展的生产。这些合成系统被设计成模拟天然EVs的脂质组成，并且可以用与EV相关的四跨膜蛋白（如CD63和CD9）进行功能化修饰，这些蛋白在EV的摄取和载荷释放中发挥着重要作用。此外，EVMs还可以用靶向肽进行修饰，以用于向特定细胞和组织递送。
此外，无论是天然EVs还是合成EVMs，其临床应用的一个持续挑战是治疗性载荷的高效装载。在目前探索的方法中，被动孵育、电穿孔、超声处理和冻融循环已被报道，每种方法在装载效率、囊泡完整性和载荷稳定性方面都存在权衡。虽然这些方法大多已针对天然EVs中装载常规小干扰RNA进行了单独评估，但针对结构化RNA纳米组装体和EVMs的并行性能比较研究仍然不足。
材料与方法
EVMs的组装与功能化
合成EVMs的制备遵循先前发表的方案，并进行了某些修改。简而言之，将脂质溶解于氯仿中，使用以下摩尔比：55%胆固醇，29% 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC），10% 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸（DOPS），4%鞘磷脂（SM）和2% 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[（N-（5-氨基-1-羧戊基）亚氨基二乙酸）琥珀酰]镍盐（DGS-NTA(Ni)）。蒸发有机溶剂形成干燥的脂质膜，随后用含有10 mM MgCl2的磷酸盐缓冲盐水（PBS）进行水合，最终脂质浓度为6 mM。将悬液震荡5分钟以获得多层囊泡（MLVs）。通过探针超声处理（5秒开/关循环，15%振幅，15分钟）在冰浴中将MLVs转化为小单层囊泡（SUVs）。将得到的悬液在100,000g下离心30-70分钟，将沉淀重悬于PBS/MgCl2中。接下来，将SUVs与含氟表面活性剂的FC-40油相以2:1的油水比进行乳化。添加三嵌段表面活性剂至最终浓度为1.25 mM，将混合物以最大速度乳化60秒，随后在4°C下孵育至少2小时。去除多余的油相，将PBS和全氟-1-辛醇（PFO）以1:1:1的比例添加到液滴混合物中，并在4°C下孵育30分钟。收集含有EVM的水相，在100,000g下离心30-70分钟，将得到的沉淀重悬于pH 7.6、含有150 mM NaCl的PBS中。对于表面功能化，将EVMs与带有组氨酸标签的肽在37°C下以1:100的蛋白-脂质摩尔比孵育1小时。随后用含有0.1%牛血清白蛋白的PBS洗涤囊泡，并在100,000g下离心30-70分钟。将沉淀重悬于PBS中。EVMs可在4°C下保存长达一周，或在-80°C下长期保存。
肿瘤来源EVs的分离
通过差速超速离心法分离EVs，然后进行尺寸排阻色谱法纯化。简而言之，收集在单层培养至80%汇合度的人黑色素瘤细胞的条件培养基，并在室温下依次以300g离心10分钟和2000g离心10分钟。接下来，将上清液在4°C下以10,000g超速离心30分钟，随后在4°C下以100,000g超速离心2小时（使用Beckman Coulter Optima XE-90，SW28转子）。将EV沉淀用PBS洗涤，在4°C下以100,000g再次离心2小时，重悬于500 μL PBS中，并上样到qEV 70 nm色谱柱上。随后加入8 mL PBS，并将流出液收集为7个1 mL的组分。将富含EVs的组分（第2至第4组分）合并，并在-80°C下保存用于后续实验。根据2023年细胞外囊泡研究最低信息共识指南对EVs进行表征。
EVMs和肿瘤来源EVs的表征
使用纳米粒子追踪分析（NTA）来测定EVMs和EVs的浓度和尺寸，使用NanoSight NS300设备，在25°C下进行五次测量，每次60秒。通过蛋白质印迹法评估EV标志物和肽的结合情况。使用透射电子显微镜（TEM）观察囊泡结构。将EVMs滴加到铜网上（浓度为3.5-20 × 1010EVs/mL），并根据制造商的说明使用磷钨酸进行负染色。图像在JEOL JEM-1011透射电子显微镜上采集。
蛋白质印迹
将1010个EVs上样至10% SDS-PAGE凝胶。将膜在室温下用含有5%脱脂奶粉的0.1% TBS-吐温溶液封闭1小时，随后在4°C下与一抗孵育过夜，然后在室温下与二抗孵育1小时。使用化学发光底物显色蛋白质条带，并在Bio-Rad Chemi-Doc成像系统中观察。
NANPs的制备
所有序列列在支持信息中。Dicer底物（DS）RNA序列以及用于转录功能性NANPs（RNA立方体和RNA环）的RNA链的DNA模板购自Integrated DNA Technologies公司。使用含有T7 RNA聚合酶启动子的引物扩增DNA模板。转录反应包含80 mM HEPES-KOH（pH 7.5）、2.5 mM精胺、50 mM二硫苏糖醇、2 mM MgCl2、25 mM核糖核苷三磷酸、0.2 μM DNA模板和约100单位/μL的内部制备的T7 RNA聚合酶，并在37°C下孵育4-16小时。随后用DNase I在37°C下处理30分钟降解DNA模板。使用8 M尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化RNA链。通过以等摩尔比例混合单体来组装RNA立方体和RNA环。将混合物在95°C下变性2分钟。对于RNA立方体，将样品转移至45°C并孵育2分钟，随后加入组装缓冲液（2 mM MgCl2，50 mM KCl，89 mM Tris-硼酸）并在45°C下进一步孵育20分钟。对于RNA环，将样品在冰上快速冷却2分钟，加入组装缓冲液，并将混合物在30°C下孵育30分钟。
NANPs的物理化学表征
为了确认NANPs的组装，在含有89 mM Tris-硼酸（pH 8.2）和2 mM MgCl2的缓冲液中进行8%非变性天然聚丙烯酰胺凝胶电泳。使用Mini-PROTEAN Tetra系统在4°C、300伏下运行凝胶20分钟，用去离子水洗涤，并用溴化乙锭染色。使用ChemiDoc MP系统观察NANPs。使用MultiMode AFM Nanoscope IV，在轻敲模式下，在经过1-（3-氨丙基）硅烷修饰的新鲜剥离云母表面上对功能性RNA立方体和RNA环进行原子力显微镜成像。
EVMs的装载
使用四种策略将合成EVMs装载货物（乱序或抗GFP的DS RNA，或功能化了抗GFP DS RNAs的NANPs），输入浓度为150 nM：电穿孔、冻融循环、被动孵育和超声处理。对于电穿孔，将EVMs与货物混合，在酸性缓冲液中，使用Eppendorf 2510电穿孔仪，在1毫米间隙的比色皿中接受五次电脉冲。然后将样品置于冰上5分钟，短暂涡旋，并在37°C下孵育1小时以使膜恢复。对于冻融循环，将EVMs与货物混合，并经历五次在干冰上快速冷冻和在37°C下解冻的循环，随后在37°C下孵育1小时以使膜稳定。对于被动孵育，将EVMs和货物在37°C下孵育过夜以使货物结合。对于超声处理，将EVMs和RNA货物进行水浴超声处理，随后在37°C下孵育1小时。装载后，用RNase A处理EVMs以去除未封装的RNA，并通过超速离心纯化。将沉淀重悬于PBS中以供下游分析。
细胞培养实验与三维球体形成
人黑色素瘤细胞系A375、SKMel-28和WM-1366；三阴性人乳腺癌细胞MDA-MB-231；以及THP-1 Dual人单核细胞（一种用于监测NF-κB和IRF通路激活的报告细胞系）在37°C、含5% CO2的湿润气氛中培养。SKMel-28细胞在补充有10%胎牛血清和1 mM丙酮酸钠的最低必需培养基中维持。A375、WM-1366和MDA-MB-231细胞在补充有10%胎牛血清的杜氏改良培养基中培养；对于MDA-MB-231细胞，培养基还补充了1%青霉素-链霉素。根据制造商指南维持THP-1 Dual单核细胞，交替使用生长培养基、选择培养基和用于实验检测的测试培养基。对于EV实验，细胞用经过超速离心去除EVs的胎牛血清培养。单层细胞在标准组织培养板中维持。对于球体形成，将1000-5000个细胞/孔接种到预先包被有1%琼脂糖层的96孔板中，并在1,150相对离心力下离心5分钟。72小时后观察到完全形成的球体。
摄取研究
通过亲脂性染料标记或通过监测作为货物包装的Alexa Fluor 488标记的DS RNAs的内化来评估EV和EVM的摄取。对于基于染料的标记，根据制造商的说明，用PKH26或CellVue Lavender染料对EV和EVMs进行染色。简而言之，将2 μL PKH26或CellVue Lavender染料在500 μL稀释剂C中稀释，并与500 μL EV悬液混合。将混合物在室温下孵育10分钟，并通过用PBS洗涤然后在4°C下以100,000g超速离心2小时去除多余的染料。对于DS RNA装载，如上所述，通过电穿孔将EVs和EVMs装载100 nM Alexa Fluor 488标记的All Stars阴性对照小干扰RNA。将染色后的囊泡添加到3天龄的球体中，并在37°C下孵育过夜。第二天，去除含有未掺入EVs的培养基，用PBS洗涤球体，在荧光显微镜下成像，并将其解离成单细胞悬液。通过流式细胞术测定PKH26+、CellVue Lavender+或Alexa Fluor 488+细胞的百分比来量化摄取。对于这些实验，每个数据点代表来自八个合并球体的阳性细胞平均百分比。
基因沉默与毒性研究
将装载有靶向GFP的DS RNAs或NANPs的EVs和EVMs添加到作为单层或球体生长的MDA-MB-231-eGFP细胞中。对于单层，在治疗前24小时将细胞以10,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。对于球体，将5000个细胞/孔接种在琼脂糖包被的板中，培养3天后再进行治疗。使用Nanodrop2000定量装载的EVs中的RNA浓度。细胞用15或42 nM小干扰RNA，或2.5或7 nM立方体或环状NANPs（每个包含六个小干扰RNA）处理一次，在所有装载方法中保持一致的RNA浓度。阳性递送对照包括Lipofectamine 2000和DOTAP/DOPE复合物，它们与小干扰RNA或NANPs在室温下孵育30分钟后添加到细胞中。治疗72小时后，通过流式细胞术评估GFP沉默。通过标准化到GFP阳性的MDA-MB-231-eGFP细胞和亲本非GFP的MDA细胞来计算GFP抑制。为了评估活力，将来自单层或解离球体的细胞用PBS洗涤，并用PBS/1% BSA/2 mM EDTA中的5 nM Sytox Red染色。在室温下15分钟后，通过流式细胞术分析样品，并使用OVERTON分析工具确定EV摄取和细胞毒性。
结果
合成EVMs与肿瘤来源EVs的表征与比较分析
EVMs按照已建立的方案进行组装，并进行了修改。如图1a示意图所示，从模拟大多数天然EVs脂质组成的混合物中产生多层囊泡，随后将其加工成小单层囊泡，并通过组氨酸标签-NTA镍结合功能化CD63和CD9肽。蛋白质印迹分析证实了CD63和CD9在EVMs中的掺入，并将其水平与天然黑色素瘤来源的EVs中的水平进行了比较。黑色素瘤EVs在不同细胞系中显示出不同的表达水平，重要的是，用CD63和CD9肽修饰的EVM对这些标志物呈阳性，表明表面功能化成功。值得注意的是，在EVM中观察到的CD63和CD9分子量较低，这可能反映了使用的是肽而非全长蛋白，并且缺乏翻译后修饰。此外，与亲本细胞相比，黑色素瘤来源的EVs中缺乏内质网标志物钙联接蛋白，证实了EV制备物的纯度以及没有细胞碎片污染。
纳米粒子追踪分析显示，EVMs的平均尺寸约为260-270纳米，并呈现双峰尺寸分布，这反映了组装过程中产生的异质性囊泡群体。透射电子显微镜进一步证实了它们在不同尺寸下的膜状球形形态，该形态不受CD63和CD9修饰的影响。相比之下，黑色素瘤来源的EVs略小，平均尺寸范围约为160至200纳米。
有趣的是，用PKH26标记的囊泡处理的SKMel-28球体的荧光显微镜检查显示出不同的摄取模式，与仅含脂质的颗粒相比，EVM在球体周边显示出优先定位。通过对球体解离后进行流式细胞术的定量分析显示，样品之间PKH26阳性细胞的总体百分比相似，这表明在SKMel-28球体中，表面修饰影响的是摄取的定位而非总的内化。
为了进一步评估EVM与天然黑色素瘤EVs相比的摄取和细胞内货物递送能力，通过电穿孔将肿瘤来源的EVs和EVMs装载Alexa-488标记的乱序DS RNA，并添加到三天龄的球体中。过夜孵育后，荧光显微镜显示出相似的摄取模式，而流式细胞术显示，与天然EVs相比，EVMs和EVM的Alexa-488阳性细胞百分比更高，这可能是由于它们缺乏预先存在的货物，从而促进了腔内装载。摄取值根据囊泡数量进行了标准化，因为球体用等体积的EV制备物处理，尽管后续的NTA分析表明各组间的囊泡浓度存在差异。
接下来，我们使用THP-1 Dual单核细胞作为模型，评估了黑色素瘤来源的EVs和EVMs对人髓系细胞的影响。细胞在三天内接受处理，每24小时添加一次囊泡。为了清晰起见，囊泡处理在0小时开始，并在24小时和48小时重复。在初次处理后24、48和72小时评估细胞活力。每日囊泡给药用于模拟持续的、类似于体内的暴露，并确保EVs和EVMs之间的处理条件可比。结果显示，用黑色素瘤来源的EVs处理会随时间推移减少存活的THP-1细胞数量，其中来自原发病灶黑色素瘤细胞系的EVs引起的减少最为显著。仅含脂质的EVMs在72小时时也诱导了活细胞数量的减少，而EVM对THP-1 Dual细胞的增殖没有显著影响。
通过Sytox Red染色随后进行流式细胞术进一步评估细胞活力，该检测通过测量质膜完整性的丧失作为细胞死亡的指标。与台盼蓝排除法的结果一致，天然黑色素瘤EVs诱导了显著的单核细胞死亡，这与其报道的免疫抑制潜力一致。再次，来自原发黑色素瘤细胞系的EVs在所有时间点都具有最强的细胞毒性。
通过过夜处理标记的EVs评估EV摄取，结果显示天然黑色素瘤EVs的内化率高于EVMs，并且A375和WM-1366 EVs的摄取最高，这可能与较高的抗增殖和细胞毒性效应相关。
RNA装载策略对EVM掺入效率的影响
我们的下一步是确定将不同RNAi诱导剂掺入EVMs的最有效策略。为了解决这个问题，我们比较了四种常用的装载方法：一种被动方法（在37°C下孵育）和三种主动方法：电穿孔、冻融循环和水浴超声。评估了三种通过RNAi靶向GFP的纳米结构：一个Dicer底物RNA、一个包含六个DS RNAs的RNA立方体和一个包含六个DS RNAs的RNA环。这些结构旨在通过细胞内Dicer加工释放针对GFP的小干扰RNA。将EVMs装载150 nM每种RNA结构。电穿孔采用约400伏的五次脉冲进行；冻融包括五次在干冰（2分钟）和37°C（2分钟）之间交替的循环；超声处理在35 kHz下进行30分钟；被动孵育在37°C下过夜进行。主动装载后，将囊泡在37°C下孵育1小时以使膜恢复，然后所有样品用RNase A处理以降解未掺入的RNAs，用PBS洗涤，并在100,000g下超速离心以去除非囊泡的RNA片段。
使用Nanodrop2000通过RNA吸光度在装载前后测定装载效率。结果显示，掺入效率在不同的独立重复中存在显著差异，这与先前观察到的将小亲水性货物装载到天然EVs中的情况一致。重要的是，尽管电穿孔导致所有结构发生聚集，但无论是DS RNAs还是功能性NANPs在不同的装载方法下都保持稳定，没有降解的证据。
对于DS RNAs，电穿孔产生了最高的平均掺入率。冻融循环产生了中等效率。超声处理导致较低的掺入率，而被动孵育在EVMs中表现最差，但在EVM中达到与超声处理相似的水平。
对于测试的最大三维结构RNA立方体，冻融产生了最高的平均装载效率。电穿孔和超声处理具有中等效率，但均存在较大偏差。被动孵育也导致最低的掺入率。
对于RNA环，掺入在不同重复之间最为一致。电穿孔提供了最高的效率，而冻融、超声处理和孵育产生的值相当较低，范围在4%到10%之间，未修饰和修饰的囊泡之间差异较小。
接下来，我们通过NTA评估了装载策略对囊泡浓度和尺寸的影响。在所有装载方法中，修饰和未修饰的EVMs都表现出相似的NTA谱图，这些谱图总体上与装载前观察到的相似。然而，所有方法都导致EV浓度降低和平均颗粒尺寸向更小的方向偏移，表明在掺入过程中EVs被破坏。
基因沉默效率与毒性
为了评估EVM介导的RNAi诱导剂递送的功效，在作为单层培养的MDA-MB-231-eGFP三阴性人乳腺癌细胞中评估了GFP沉默。比较了使用四种不同装载方法装载DS RNA、RNA立方体或RNA环的EVMs。由于RNA立方体和RNA环各自包含六个DS RNAs，因此使用相对于游离DS RNA低6倍的浓度，以确保所有处理中的RNAi诱导剂含量相等。
如图4a所示，在含有去EVs胎牛血清的培养基中，MDA-MB-231-eGFP单层细胞在处理前1天接种。在铺板后24小时一次性施用EVMs，使用两种RNA浓度，剂量经过调整以确保从DS RNAs和NANPs经Dicer介导释放后得到等效的小干扰RNA递送。在处理后72小时通过流式细胞术和/或显微镜评估GFP沉默和细胞毒性。尽管RNAi输入量相等，但电穿孔是最有效的装载方法，特别是在较高剂量下，实现了与常规脂质载体可比的GFP沉默。相比之下，其他装载策略仅产生最小的沉默活性。
在不同的RNA纳米结构中，沉默效率总体上相似，其中RNA环显示出GFP沉默的适度增加，特别是在EVM中。在细胞毒性方面，通过Sytox-Red染色评估，EVM显示出比Lipofectamine 2000和DOTAP/DOPE更低的毒性。值得注意的是，这些阳离子载体表现出内在的细胞毒性，当与NANPs或DS RNA结合时，细胞毒性进一步增强，而单独的EVMs没有显示出显著的细胞死亡诱导。
由于体外功效向体内环境的转化受到组织复杂性和三维环境中纳米颗粒渗透有限的制约，我们接下来评估了MDA-MB-231-eGFP球体中的GFP沉默。允许球体形成3天，然后用与单层实验相同浓度的EVMs进行处理。在第6天（即处理后72小时）评估GFP沉默和细胞毒性。正如预期的那样，球体中的沉默效率通常低于单层细胞。然而，电穿孔装载的EVMs在所有RNA结构上都优于脂质载体，实现了更高的GFP沉默。通过解离和Sytox-Red染色进行的球体细胞毒性分析显示，模拟物诱导的毒性谱与脂质载体相似，但沉默效力更高。有趣的是，与单层培养的细胞类似，DS RNAs显示出比NANPs更低的毒性，这可能归因于IRF激活，这在治疗背景下可能是有利的。
讨论
EVs现在被认为是强大的细胞间通讯介质。它们将功能性生物分子（包括蛋白质、脂质和核酸）递送到特定靶细胞的内在能力，使其成为有前景的下一代药物递送系统候选者。特别是，EVs越来越多地被探索作为RNA药物的治疗载体，与其他纳米载体相比，具有生物相容性、低免疫原性和增强的货物转移效率等优势。
尽管有这些潜力，但EVs的临床转化仍然受到大规模生产、高效货物装载和功能工程化方面挑战的限制。尽管临床前研究已经证明了使用EV载体进行RNAi疗法在体外和体内都取得了有希望的结果，但实现一致且高效的货物封装仍然是一个主要障碍。
主动装载方法，如电穿孔、冻融循环和超声处理，通常被使用，它们会导致瞬时膜通透性，从而能够装载外源性货物。其中，电穿孔是最常用的方法，通过施加电场导致EV透化，装载效率在0.05%到60%之间。超声处理是第二常用的策略，通过空化效应诱导机械破坏，封装效率在8%到30%之间。冻融循环虽然使用频率较低，但通过冰晶形成诱导膜透化，显示出良好的装载能力，效率在3%到55%之间。另一方面，被动孵育通常对疏水性货物有效，但对亲水性分子的效率较低，装载效率通常低于10%。
大多数装载方法总体上表现出较低且变异很大的效率，这可能与多个参数有关，包括EV组成、货物的生化特性以及装载参数（如装载周期数和持续时间）。此外，天然EVs的内在复杂性，包括其内源性货物和表面成分，可能进一步影响治疗性货物的掺入。这一点，连同其低产量和具有挑战性的功能化，限制了它们作为载体的治疗用途。
在此背景下，合成EVMs的开发具有缺乏细胞特异性趋向性和货物，以及允许直接功能化和可扩展生产的优势。先前的研究已证明了自下而上组装完全合成的、类似于EV脂质组成并用四跨膜蛋白CD63和CD9功能化的囊泡的可行性，这些蛋白在EVM内化和货物递送中发挥重要作用。这些合成囊泡已成功递送功能性小干扰RNA用于伤口愈合治疗，支持了EV启发的合成递送系统的可行性。
在肿瘤学中，基于RNAi的疗法可以通过靶向疾病相关通路和克服内在及获得性耐药机制来增强治疗效果。然而，肿瘤耐药性通常是多因素的，经常需要组合策略。在这种情况下，使用NANPs提供了重要的优势，因为它们可以在单个颗粒内同时递送多个相同或不同的DS RNAs，从而实现Dicer辅助的小干扰RNA释放和多靶点基因沉默，同时还可以通过激活RIG-I和诱导IRF信号传导作为免疫刺激剂。这种基因沉默和免疫激活的双重方法最近得到了探索，其中红细胞来源的EVs同时携带KRAS靶向的反义寡核苷
