综述：生命密码之愿景：用于深度RNA/DNA照明的分子探针纳米结构学

《ACS Nano》：Vision of Life’s Code: Molecular Probe Nanoarchitectonics for Deep RNA/DNA Illumination

这篇综述文章系统梳理了细胞内RNA与DNA同时成像领域的关键挑战与技术进展。它深入剖析了多重探针带来的复杂性、低准确度和假阳性等问题，并从生物学家（用户）的视角，提出了通过纳米结构学（nanoarchitectonics）设计单步多重RNA/DNA成像分子探针的框架，旨在为开发下一代兼具高特异性、近红外（NIR）激发、高光稳定性的实用型成像工具提供指导。

　　

引言：迈向实用的分子纳米结构学

科学技术的目标是为人类和社会发展做出贡献。将纳米尺度的科学知识转化为有用的材料至关重要。这需要推动一个融合材料化学与纳米技术进步的概念。纳米结构学（nanoarchitectonics）这一后纳米技术概念应运而生，它整合材料化学和纳米技术，从原子、分子和纳米材料等纳米单元构建功能材料。本综述的主要目标是发展实用的分子纳米结构学，并以生物应用——特别是RNA/DNA同时成像技术——作为目标范例。

聚焦目标：识别细胞内RNA/DNA成像的关键空白

在复杂的生物系统中实现精确的RNA/DNA成像需要扎实的生物学背景、对分子探针的高要求以及准确的生物成像系统。然而，现实是大多数成像系统因需要使用多种RNA和DNA探针而无法满足生物学研究需求，这可能增加复杂性、在生物系统中准确性低且缺乏对假阳性的认识。本综述旨在：（i）提请关注在应用多种RNA和DNA探针进行细胞成像中长期存在但常被忽视的问题；（ii）概述和比较当前用于同时进行RNA和DNA成像的技术；（iii）研究其潜在机制，为设计下一代成像工具的策略提供信息；（iv）强调我们近期可能具有解决当前问题潜力的发现；（v）讨论新概念并提供指南，连同其局限性和可能性，以改进RNA/DNA探针的开发，用于深入的生物学研究。

从多步到单步染色：在复杂生物系统中的跨越

多重RNA/DNA成像为研究细胞活动的结构和功能动力学开辟了新途径。然而，在同一实验中将DNA和RNA成像探针结合起来本质上是成问题的（图1），因为每种探针针对不同靶标设计，需要不同的实验条件。在复杂的生物系统中，这些挑战变得尤为突出。因此，迫切需要开发在单一条件下、与RNA和DNA兼容的单步多重RNA-DNA细胞成像方法。

历史脉络：从困难到简易且信息丰富的RNA/DNA成像技术演进

多年来，核酸成像领域已从早期的传统方法演变为能够同时可视化RNA和DNA的更先进技术（图2和图3a）。其中，使用化学探针的荧光成像是标记RNA和DNA最简单的方法，无需专业的生物学知识即可进行。然而，其分子设计和染色方案必须经过充分优化才能获得真阳性成像结果（图3b）。

屈指可数：用于同时细胞内RNA/DNA检测的化学探针

尽管在开发用于RNA和DNA成像的化学探针方面已取得相当大进展（图3b和图4），但由于成像问题，如低光稳定性、非特异性结合、对环境因素（例如pH、离子强度）的敏感性，以及同时区分RNA和DNA这一最重要挑战，该领域仍面临复杂性。

早期工作很大程度上依赖于吖啶橙（Acridine Orange, AO），因其在1940-1950年代能够选择性染色核酸而成为广泛使用的工具（图5）。然而，AO及其衍生物存在插入碱基对之间、导致DNA螺旋长度增加、空间电荷分布改变等问题。此外，它们的pH敏感性和对紫外（UV）激发的需求常常导致成像不可靠。

为了克服AO的灵敏度问题，开发了基于花青的染料，称为SYTO染料及其衍生物。尽管SYTO可与RNA和DNA结合，但其DNA/RNA光谱重叠、光漂白速度快，限制了其在需要高强度激光照射的长时间或定量成像中的适用性。

随后，LUCS-9、阳离子碳量子点（Cationic Carbon Quantum Dots, CQDs）、TO3-CN、DR1等探针被相继开发，各自在光稳定性、光谱区分度或细胞渗透性方面有所改进，但仍存在诸如光谱重叠、光稳定性不足或需要紫外激发等限制。

近期的一项显著进展是开发了针对富氮结构化合物（称为TEG₈-N14）的优化染色策略，可在近红外（NIR）双激发下同时可视化RNA和DNA（图6）。这种近红外激发不仅最大限度地减少了光毒性和光谱串扰，而且在测量不同细胞类型的多种细胞损伤方面显示出广泛的适用性。该探针通过沟槽结合而非插入方式与DNA结合，从而降低细胞毒性并避免DNA双螺旋变形。

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总而言之，虽然有许多探针能够在细胞中结合DNA和RNA，但迄今为止，只有四种类型的探针——AO及其衍生物、CQDs、DR1、TEG₈-N14——具备同时进行DNA和RNA成像的能力。

有前景的探针与流程：生物学家的视角

尽管完美的探针并不存在，但关键的设计要素对其最佳性能至关重要。以下概述开发化学探针的几个关键设计标准及其显著影响性能的局限性。

生物窗口：通用应用之门

生物细胞和组织的复杂结构常常导致不透明，主要是由于生物环境中不必要的光散射和吸收，这限制了光学成像的穿透深度并引起来自内源性荧光团的不必要自发荧光。对于细胞成像应用，选择适当的近红外生物窗口取决于实验背景。

光致发光量子产率并非首要考虑因素

虽然光致发光量子产率是一个重要的光物理参数，但非常高的量子产率不一定是最关键的因素，因为探针一旦定位到特定区域或与生物介质中的特定生物分子相互作用，其行为可能不同。因此，应更多地考虑探针内化后的细胞亮度。

过度敏感性：分析复杂性的来源

虽然探针灵敏度对于传感应用至关重要，但多重灵敏度使数据解释复杂化并增加了严格校准的要求。因此，仅具有特定敏感性的探针比具有高敏感性的探针更受青睐。

亮度与光稳定性之间的权衡

通过避免快速光漂白，探针不仅可用于定量和长期成像，还可用于超分辨率显微镜。然而，在探针设计中实现亮度与光稳定性之间的平衡仍然是一个主要挑战。

细胞渗透性：并非总是生物成像应用的障碍

细胞渗透性是追踪活细胞动态过程的关键因素。然而，探针有限的渗透性并不一定妨碍其实际应用。例如，碘化丙啶（Propidium Iodide）和DAPI已被广泛用于检测质膜破裂和其他形式的细胞死亡。

多重分析：绘制细胞器相互作用图谱，并确保探针间的兼容性

多重荧光成像能够在单一步骤中同时检测细胞内的多个靶标，揭示靶标之间的关系。没有这种能力，就很难识别信号之间的关系、分析它们的相互作用，以及理解这些生物过程在病理条件下如何发生故障。

保留时间：记录完整细胞历史的障碍

荧光团在亚细胞器中的保留时间直接影响其长期成像性能。探针应保持定位于其靶标而不干扰细胞代谢活动，同时避免由血清或其他细胞外成分引起的非特异性泄漏。

其他生物分子的干扰：对成像准确性的影响

与细胞中蛋白质、脂质或其他生物分子的非特异性结合可能导致脱靶荧光、淬灭、局部光热效应或光谱失真。优化化学探针以减少此类相互作用对于在拥挤的生物环境中实现高靶标选择性至关重要，尤其是在定量成像中。

超越简单：精确选择和未来开发的考量

推进下一代探针需要深入了解它们如何与其生物靶标相互作用。一旦进入细胞，探针会遇到由生物大分子、离子、膜和其他细胞成分组成的高度拥挤的环境。这种复杂性使得确定精确的结合位点以及这些相互作用如何影响成像结果变得具有挑战性（图9）。

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由于最近的发展，人工智能（AI）和机器学习（ML）为预测生物反应和定制分子识别以指导探针设计和个性化药物递送做出了贡献。尽管取得了这些进展，但缺乏高质量和标准化的AI数据集常常导致数据碎片化、报告不一致以及表面化学与生物学结果之间缺乏连贯性。

揭示这种染色机制最可靠的方法之一是直接分子观察和不同化学结构的原位表征。作为长期发展目标，建议以下两个重要领域：

扫描隧道显微镜/原子力显微镜（STM/AFM）

使用荧光分子在原子分辨率下成像DNA和RNA极具挑战性，但表面技术如STM/AFM可能为实现这一目标提供可能的途径。例如，利用CO修饰的针尖进行非接触式原子力显微镜（NC-AFM）能够以亚纳米分辨率对单链DNA（ssDNA）进行成像（图10）。

原位表征

为了更好地理解分子探针的潜在染色机制，有必要比较探针的不同化学结构，并评估它们在生物环境中的性能。需要使用光谱测量、等温圆二色谱、微量热泳动或X射线晶体学等技术进行深入研究，以阐明影响探针选择性、亮度和细胞行为的结构-功能关系。

重新思考人工智能在数据分析中的应用并关注伦理问题

分析庞大而复杂的成像数据集非常耗时，并且需要高水平的显微镜专业知识。基于人工智能的平台，如Leica的Aivia和Imaris，已被开发用于自动分割和量化。虽然这些平台提供了许多好处，但必须谨慎应用。

扎实的生物学知识是获得准确结果的先决条件

生物系统是高度动态和相互关联的，即使细胞状态或环境的微小差异也可能显著影响实验结果。因此，准确解释成像数据需要对生物学原理和背景有深入的理解。

为表征仔细选择每个实验组件

在推进到探针开发的下一阶段之前，表征是必不可少的。以下概述了探针表征的几个重要注意事项。

检测设备的灵敏度

每个探针的性能取决于其与细胞结合后光物理特性的表征。探测器、激光器、物镜数值孔径和其他光学元件等关键组件必须经过适当校准，以在实验过程中保持信号稳定并降低噪声。校准不足和缺乏阳性对照可能导致假阳性，并误导对探针行为的解释（图11）。

固定方法的选择及为何没有“一刀切”的解决方案

在样品标记的初始阶段，固定应保持样品的结构完整性，以紧密反映活体样品的状态；然而，这个过程容易引入伪影。没有通用的固定方案，因为在一种条件下表现良好的固定剂在另一种条件下可能不理想。

细胞培养平台

为成像选择细胞培养平台时，最重要的考虑因素是其能否紧密模拟天然组织环境。细胞类型、细胞外基质组成和培养平台等因素可显著影响探针的摄取、分布和生物反应。

商业化：平衡可扩展性、质量控制、安全性和成本

将成像探针从实验室转化为商业用途需要在可扩展性、质量控制、安全性和成本之间取得平衡。商业荧光团必须满足一致性的标准，同时保持学术和工业研究人员的广泛可及性。确保这种平衡对于整个RNA/DNA成像的有效应用至关重要。

展望与提议

本综述聚焦于RNA/DNA成像，旨在发展实用的分子纳米结构学。尽管这一目标是基础性的，但我们从用户的角度审视是否有用的技术已被开发，并讨论了必要的未来方向（图12）。开发能够区分DNA和RNA、实时精确成像并密切监测其行为的分子材料和技术至关重要。

最近，已经开发出满足许多这些标准的探针。例如，本综述中讨论的TEG₈-N14证明了富氮结构化合物在利用双近红外激发同时可视化RNA和DNA方面的重要性。这一突破不仅由于近红外激发而最大限度地减少了光毒性和光谱串扰，而且在测量不同细胞类型的多种细胞损伤方面展示了广泛的适用性。

本综述旨在概述生物成像的最新发展，强调当前被忽视的细胞内成像问题，并提供生物学见解，以鼓励各个领域的研究人员探索与其研究相关的新策略。我们的目标是帮助生物学家为其研究选择最合适的方法，并支持未来的研究人员从生物学家的角度开发下一代RNA/DNA探针，从概念构想到商业化。

未来RNA/DNA探针分子的理想标准

1. 1.
   高序列特异性——能够识别一个确切的DNA或RNA序列。
2. 2.
   近红外激发和发射——避免自发荧光和光散射；与常用探针的光谱重叠低。
3. 3.
   最小的光诱导化学反应——低光热效应和光毒性，以避免在照明下形成反应性副产物。此类特性允许对慢速和快速的生物过程进行重复成像。
4. 4.
   单参数敏感性——例如，仅对核酸变化有响应，而非对pH、聚集等，尽管盐波动或其他环境因素，性能稳定。
5. 5.
   在特定细胞内靶标处高积累——实现高信噪比，确保与任何显微镜兼容，即使在拥挤的细胞内空间也表现良好。
6. 6.
   随时间稳定的信号——在长时间的实验中，在靶标处保持足够的信号。
7. 7.
   高细胞渗透性——提高亮度和整体成像性能。
8. 8.
   与其他探针的低交叉反应性——允许可靠的共染色。
9. 9.
   尺寸小——便于轻松扩散到紧密连接的细胞。
10. 10.
    高光稳定性——与超分辨率显微镜兼容，包括使用高强度激光的受激发射损耗（STED）显微镜。
11. 11.
    最小干扰——不干扰正常的细胞过程或基因表达，与膜的相互作用最小化以避免粘附到脂质双分子层。
12. 12.
    在各种细胞类型中表现良好——广泛适用于各种类型的哺乳动物细胞，如果可能，也适用于植物、细菌和模式生物。
13. 13.
    最小沉淀——在制备过程中保持溶解性。
14. 14.
    最小清洗能力——最大限度地减少任何干扰。
15. 15.
    高化学稳定性——在长期储存条件下随时间保持其性能。
16. 16.
    与流式细胞术兼容——可适应各种成像平台。
17. 17.
    选择正确的固定方法——成像结果不得受固定过程影响。
18. 18.
    易于功能化——可以连接到靶向配体、肽或抗体。
19. 19.
    长保质期——在长期储存期间稳定。
20. 20.
    可扩展且成本效益高的合成——对于大规模研究可行。
21. 21.
    批次间高重现性——性能一致。

当然，确保在动态治疗过程中可靠的定量传感能力需要扎实的生物学知识和准确的结果。其他重要因素包括：为表征仔细选择每个实验组件；在细胞培养平台中为长期成像提供3D环境；以及为这些技术的商业化平衡可扩展性、质量控制、安全性和成本。使用原位表征技术进行全面评估也至关重要。新方法，如引入人工智能技术和使用探针显微镜进行直接分子水平观察，预计将做出重大贡献。用于分子设计的纳米结构学和评估方法的完善将导致在单一步骤下、与RNA和DNA兼容的条件下发挥作用的多重RNA-DNA成像技术的发展。这将使其对用户更加有用。