《Journal of the American Chemical Society》：TAV2b Peptide Derivatives Underwind and Stabilize Double-Stranded RNA upon Binding
编辑推荐：
本研究通过单分子磁镊技术，首次揭示了源自番茄不育病毒2b蛋白（TAV2b）的两种肽类衍生物wt33和1′-1′与长双链RNA（dsRNA）结合的动态力学机制。研究发现，这两种肽均能解旋（underwind）dsRNA并稳定其构象，同时显著改变其机械特性（如降低持续长度（Lp）），为基于dsRNA的RNA干扰（RNAi）疗法提供了稳定dsRNA、优化递送与释放（如1′-1′依赖二硫键断裂）的新策略。
引言
RNA已成为理解和调控生物过程的关键工具，在治疗应用中展现出巨大潜力，例如RNA干扰（RNAi）技术。然而，长双链RNA（dsRNA）在生物环境中的稳定性差和细胞摄取效率低限制了其应用。受天然RNA结合蛋白的启发，来源于番茄不育病毒2b（TAV2b）蛋白的肽类dsRNA结合剂（如野生型肽wt33和高亲和力同源二聚体衍生物1′-1′）为解决这些限制提供了有前景的工具。然而，这些肽如何识别RNA并影响其机械特性尚不完全清楚。本研究采用单分子磁镊技术，深入探究了TAV2b衍生物对长dsRNA分子生物物理特性的调控作用。
材料与方法
研究构建了长约3.2 kbp的dsRNA分子，其一端用生物素标记，另一端用地高辛标记，将其固定在链霉亲和素包被的磁珠和抗地高辛抗体包被的流动池表面，形成可拉伸的tether。使用高精度磁镊装置进行实验，通过控制磁铁位置施加力，并旋转磁铁引入扭矩，从而实现对dsRNA分子的力谱和扭矩谱实时测量。实验包括动态力-拉伸曲线（动态力-伸展）和旋转-拉伸曲线（旋转-伸展）测量。通过拟合不可伸展的蠕虫状链（WLC）模型和可伸展的Odijk WLC模型，从力-拉伸曲线中提取dsRNA及其肽复合物的轮廓长度（Lc）、持续长度（Lp）和拉伸模量（S）等弹性参数。此外，还通过分析旋转-拉伸曲线中的零扭转峰位移，量化肽结合引起的dsRNA螺旋扭转变化。为研究结合动力学，在恒定扭矩（-100转）和力（4 pN）下，监测加入肽后tether末端距离（z方向延伸）的变化，以此计算表观结合速率（kb，app）。所有实验均在25°C的磷酸盐缓冲液（PBS）中进行。
结果
肽wt33解旋dsRNA并改变其轮廓长度和持续长度
动态力-拉伸实验表明，加入10 μM wt33后，dsRNA的轮廓长度从965 nm（中位数）增加至1106 nm，表明肽结合使dsRNA延伸。同时，持续长度从45 nm显著降低至10 nm，意味着dsRNA的弯曲刚性大幅下降。拉伸模量也从571 pN降至355 pN，表明肽使dsRNA沿螺旋轴更容易伸展。
旋转-拉伸实验进一步揭示，wt33的结合使dsRNA发生解旋（underwinding）。在0.5 pN力下，零扭转峰向左（负扭转方向）移动约-15转；在4 pN力下，移动约-10转，且这种移动在肽浓度高于6 μM时达到饱和。此外，在负扭矩下施加肽时，观察到dsRNA末端距离减小，表明wt33能稳定低扭转状态的dsRNA构象，并促进plectoneme（超螺旋环）形成。
二聚体肽1′-1′解旋dsRNA并在还原条件下解离
对于二聚体肽1′-1′，动态力-拉伸实验显示，在力低于1 pN时，tether会坍塌至流动池表面，这可能是由于肽-肽相互作用导致dsRNA发生凝聚。尽管如此，通过拟合高力区数据，仍测得结合后轮廓长度增加至1022 nm。旋转-拉伸实验（在4 pN下进行）表明，1′-1′同样使dsRNA解旋，零扭转峰左移约-13转，并在约4 μM浓度时达到饱和。实验还证实，1′-1′与dsRNA的结合非常稳定，只有在引入还原剂三（2-羧乙基）膦（TCEP）断裂其二硫键后，dsRNA才会从肽复合物中释放出来，这模拟了其在细胞质中的环境敏感性释放机制。
wt33与dsRNA快速平衡并稳定其低扭转状态
为量化肽结合分数并探究结合机制，研究在恒定扭矩（-100转）和力（4 pN）下进行了实时结合实验。在该条件下，dsRNA tether是双链区和熔解区的混合物。加入wt33后，tether的z方向延伸迅速下降，这是由于肽结合稳定了dsRNA的双链构象，导致局部“重新退火”，并因tether在扭转约束下为补偿结合引起的扭转变化而形成plectoneme。延伸下降的程度随肽浓度增加而增加，在8 μM时达到饱和（Δz ≈ 0.4 μm）。数据分析支持一个两步平衡反应模型：dsRNA在双链和熔解构象之间波动，随后肽结合到双链区，最终形成plectoneme。肽的结合是可逆的，冲洗掉肽后，tether延伸可完全恢复。相反，1′-1′的结合则不可逆，除非暴露于还原条件。
TAV2b–dsRNA复合物的结构分析显示dsRNA螺旋解旋
通过将TAV2b-dsRNA晶体结构（PDB 2ZI0）与未结合的A型dsRNA叠加进行结构分析发现，TAV2b二聚体结合到dsRNA的主沟后，会引起螺旋解旋。具体表现为：每个螺旋 turn 的碱基对数从11个增加到12个，同时主沟宽度从11 ?增加到19 ?。进一步的manta图分析和刚性碱基对参数计算也证实了主沟变宽、螺旋扭曲（twist）减少等结构变化。这些结构上的解旋与磁镊实验中观察到的力学扭转变化定性一致。
讨论
本研究定量揭示了TAV2b衍生肽对长dsRNA力学特性的影响。wt33和1′-1′均能解旋dsRNA，并稳定其构象。wt33显著降低dsRNA的持续长度和拉伸模量，增加其柔韧性；而1′-1′则能使dsRNA在低力下凝聚。基于肽的结合足迹（每11 bp结合一个肽二聚体）和饱和时的平均扭转变化，可以估算出每个wt33肽二聚体在0.5 pN和4 pN下分别引入约-0.05转和-0.03转的扭转，而每个1′-1′二聚体引入约-0.04转的扭转。
持续长度的降低可能源于螺旋解旋和肽结合引起的螺旋构象扭曲（如碱基对的倾斜、滚动变化）。轮廓长度的增加则可能是螺旋解旋和肽诱导的延伸共同作用的结果。两种肽对拉伸模量的不同影响（wt33降低，1′-1′增加）可能与它们结构设计的差异有关：1′-1′通过二硫键二聚化，结构更紧凑，可能结合更紧密，从而增加轴向刚度；而wt33体积较大，结合较弱，同时引起解旋，从而降低了刚度。
从应用角度看，wt33降低dsRNA弯曲刚性的特性可能有助于将长dsRNA（如自扩增RNA（saRNA））包装到纳米颗粒载体中。而1′-1′在低力下凝聚dsRNA并在还原条件下释放的特性，则可能通过形成更紧凑的结构来保护dsRNA免受核酸酶降解，并实现细胞内环境触发释放，这对于基于dsRNA的疗法（如RNAi）具有重要价值。
结论
总之，本研究利用单分子磁镊技术，首次定量评估了高亲和力dsRNA结合肽如何改变dsRNA的机械特性和螺旋结构。研究不仅揭示了TAV2b衍生肽结合引起dsRNA解旋、稳定化及力学性质改变的具体机制，还提出了一个描述肽与波动dsRNA结合的两步平衡模型。这些发现为理解肽-RNA相互作用的力学基础提供了新见解，并有望指导设计更高效、具有时空控制释放功能的dsRNA结合剂，从而推动RNA疗法、靶向递送和个性化医疗等领域的发展。
