发现首个甲基乙二醛衍生的精氨酸-精氨酸糖基化交联产物MIDAL：一种新型、可逆且生物学相关的晚期糖基化终末产物

《Journal of the American Chemical Society》：Discovery of Glycation-Derived Cross-links at Arginine

这篇研究开发了一个创新的肽段平台，专门用于探索糖基化交联反应。研究者利用该平台首次发现了由甲基乙二醛（MGO）介导的精氨酸-精氨酸晚期糖基化终末产物（AGE）交联物，命名为MIDAL。研究表明，MIDAL可在温和的生理条件下快速形成并能持续数天，甚至在活细胞中产生，其丰度可超过其他已知AGEs，这提示它可能是一种动态的、具有生理相关性和潜在功能的新型交联AGE，而非仅是衰老损伤的标志物。该工作为理解糖基化交联的生物学功能提供了新视角。

　　

引言

蛋白质的共价交联在细胞功能中扮演着重要角色，涉及从增强细胞外基质到参与信号级联反应等诸多过程。其中，由内源性糖类及其代谢物自发形成的交联性晚期糖基化终末产物（cross-linking advanced glycation end products, xl-AGEs）被认为是年龄相关蛋白质损伤的主要来源，与心肌僵硬、白内障等多种疾病相关。尽管已知的AGEs中约有43%是交联型，但相较于单一修饰的AGEs，对xl-AGEs的了解仍然有限，尤其是在发现、制备和定量方面存在挑战。精氨酸（Arg）是糖基化的重要位点，尤其是在甲基乙二醛（MGO）作用下。然而，此前从未报道过由两个精氨酸残基形成的xl-AGE。

研究结果

肽段平台的构建与验证

为了深入研究糖基化交联，本研究构建了一个基于肽段的发现平台。其核心设计是在两个潜在的糖基化位点（精氨酸）之间插入一个蛋白酶（Pro-specific endopeptidase）识别序列。当发生交联时，形成的xl-AGE会使其间的肽链抵抗酶切，从而在酶解后仍能以全长肽段形式被检测到。研究者合成了一系列在两个Arg之间由不同长度甘氨酸（Gly）和脯氨酸（Pro）间隔的肽段库。

利用该平台对肽段库进行筛选，发现肽段Ac-YLRGPGRLA（肽段3）在MGO处理后能产生显著水平的两种交联AGE，其质量数变化分别为[M+144]_XL和[M+216]_XL。酶解实验证实，这些加合物能抵抗Pro肽酶的切割，确认为交联产物。其中，[M+144]_XL是丰度最高的AGE加合物。

新型Arg-Arg交联物MIDAL的发现与表征

质谱分析表明，[M+144]的质量变化可能对应多种AGE组合。通过对比酶解前后样品的保留时间，并结合串联质谱（MS²）分析，研究者成功将新型交联物[M+144]_XL与其他同质异位但非交联的[M+144]加合物（如单个四氢嘧啶THP或双[M+72]修饰）区分开来。MS²谱图中，[M+144]_XL前体离子缺乏诊断性的b、y离子碎片，这支持了其形成了环状交联结构，阻碍了常规的酰胺键断裂。

为了解析其结构，研究者使用了氘代MGO（D4-MGO）和乙二醛（GO）进行实验。结果表明，交联形成过程中未发生质子交换，且甲基并非必需，这提示了一种新颖的机制。最终，通过一维和二维核磁共振（NMR）分析，确定了[M+144]_XL的结构为甲基乙二醛衍生的二羟基咪唑烷半缩醛交联物，并将其命名为MIDAL。它存在两种异构体（MIDAL-1和MIDAL-2）。

MIDAL的形成条件与生物学相关性

研究发现，MIDAL的形成强烈依赖于两个精氨酸残基之间的距离和相对位置，肽段3的RGPGR基序是最优序列。在生理pH（7.4）和温度（37°C）下，MIDAL可快速形成（24小时内达到峰值），并且在移除MGO后，其在磷酸盐缓冲液中能持续数天，半衰期超过3天，显示了其具有一定的动态性和稳定性。

更重要的是，研究证实MIDAL可以在活体哺乳动物细胞中形成。研究者构建了将肽段3融合在绿色荧光蛋白（GFP）C端的质粒，转染HEK-293T细胞。无论是细胞直接经MGO处理，还是裂解液中的融合蛋白在珠上接受MGO处理，均能检测到MIDAL的形成，且其水平可通过优化处理条件而显著提高。

与其他已知交联AGE的比较

作为对照，研究者还将肽段3中的一个Arg分别突变为Cys（肽段6）或Lys（肽段7），以检测已知的MGO衍生交联物MICA（Arg-Cys交联）和MODIC（Arg-Lys交联）。结果表明，在相同条件下，肽段3形成MIDAL的水平显著高于肽段6形成MICA的水平，而肽段7几乎不形成MODIC。这进一步凸显了MIDAL作为一种新型且可能丰度可观的Arg-Arg交联物的重要性。

讨论与展望

本研究开发的肽段平台成功地克服了现有方法在比较xl-AGE与单一AGE丰度以及发现新型xl-AGE方面的局限。利用该平台发现的第一个Arg-Arg MGO衍生交联物MIDAL，其结构新颖，涉及稳定的半缩醛/半酰胺键。MIDAL可在生理条件下快速可逆地形成，并在细胞环境中存在，这些特性使其更接近于参与功能性信号通路的交联修饰，而非单纯的长期损伤累积标记。

研究指出，由于MIDAL与某些单一AGE（如THP）具有相同的质量数，在传统的、基于质谱的 unbiased 蛋白质组学工作流程中极易被忽略或错误归类。因此，目前对糖基化交联程度的评估可能被低估。对于具有最优排列Arg位点的底物，MIDAL有可能成为最主要的AGE。

未来工作将集中于利用该平台筛选更多潜在的MIDAL形成序列，开发特异性检测MIDAL的工具，并在内源性蛋白质和生理相关条件下评估MIDAL的生物学功能，以深入理解其在细胞信号传导和人类健康与疾病中的作用。